一株野生侧耳菌种鉴定及生物学特性

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　　摘  要：以1株野生侧耳属菌株为试验材料，采用ITS测序、同源序列比对、构建系统发育树进行鉴别，通过单因素试验确定影响其菌丝生长的因素。结果表明：该野生侧耳属菌株为哥伦比亚侧耳（Pleurotus columbinus），其菌丝生长的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为牛肉膏，最适碳氮比为10∶1，最适pH值为6.0，最适培养温度为25～30℃。
　　关键词：哥伦比亚侧耳;ITS测序;生物学特性
　　中图分类号 S646.14   文献标识码 A   文章编号 1007-7731（2019）09-0034-4
　　Abstract：A wild Pleurotus strain was used as a test material. The wild strain was identified by ITS sequencing， homologous sequence alignment and phylogenetic tree construction. The biological characteristics were determined by single factor test.The results showed that the wild Pleurotus strain was identified as Pleurotus columbinus， the best carbon source was sucrose，the best nitrogen source was beef extract，the optimum carbon to nitrogen ratio was 10：1，the optimum pH value was 6.0， and the optimum culture temperature range was 25-30℃.
　　Key words：Pleurotus columbinus;ITS sequencing;Biological characteristics
　　側耳属真菌营养价值较高，具有重要的经济价值和药用价值，是我国栽培面积较大的食用菌种类[1-2]。侧耳属的传统分类及鉴定主要是基于子实体的宏观形态和微观结构特征的由于其子实体形态受到地域分布、子实体发生时间以及环境条件等因素的影响而出现不稳定性，且一些近缘物种的子实体形态非常相似，仅仅依靠外形很难分辨，因而传统的分类方法已无法满足一些未知种属真菌的分类及鉴定要求[3-4]。随着分子生物学的发展，许多学者利用分子生物学技术进行菌物系统发育和菌种辅助鉴定，其中以ITS序列分析技术应用最为广泛。rDNA的ITS序列具有高度保守性，表现为种内相对一致，同时也有可以变化的区域，其有较为丰富的变异位点，这为种属间的区分提供了可能[5]。本研究以采自秦巴山区的1株野生侧耳菌株进行ITS测序及同源序列比对，通过构建系统发育树鉴定该菌株为哥伦比亚侧耳（Pleurotus columbinus）;同时，对其生物学特性开展了研究，旨在明确该菌株的最适碳源、氮源、碳氮比、pH值、温度等生理指标，为其后续驯化栽培提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料 供试野生侧耳菌株于2017年采自陕西省镇巴县小洋村，经组织分离获得原种备用。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 野生侧耳菌株的分子鉴定 采用DNA提取试剂盒提取DNA，利用通用引物ITS1、ITS4进行PCR扩增，将扩增后的PCR产物送上海生工进行ITS序列测序，测得序列登录NCBI网站用Blast工具进行同源序列比对，从GenBank下载搜索到排名前6位同源序列的ITS序列，应用MEGA-X软件进行系统发育分析，采用kimura2-parameter模式计算遗传距离，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树，Bootstrap参数设定为1000。
　　1.2.2 影响菌丝生长因素的确定
　　1.2.2.1 碳源 参照张国广等[3]方法进行，以葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素B110mg，琼脂20g）中20g葡萄糖的含碳量为标准，分别用与20g葡萄糖相等含碳量的玉米粉、麦芽糖、果糖、淀粉、蔗糖代替葡萄糖进行碳源因子比较试验，观察不同碳源处理对菌丝生长的影响。
　　1.2.2.2 氮源 以葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素B110mg，琼脂20g）中5g蛋白胨的含氮量为标准，分别用与5g蛋白胨相等含氮量的硝酸铵、硫酸铵、谷氨酸、酵母浸粉、牛肉膏、硝酸钾、尿素代替蛋白胨进行氮源因子比较试验，观察不同氮源处理对菌丝生长的影响。
　　1.2.2.3 碳氮比 在葡萄糖蛋白胨琼脂培养基中，改变蛋白胨添加量配成碳氮比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的培养基，观察不同碳氮比处理对菌丝生长的影响。
　　1.2.2.4 温度 在葡萄糖蛋白胨琼脂培养基中，分别设置15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等5个培养温度，观察不同温度处理对菌丝生长的影响。
　　1.2.2.5 pH值 在葡萄糖蛋白胨琼脂培养基中，调节pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，观察不同pH值处理对菌丝生长的影响。
　　1.3 项目测定 以上每个处理3次重复，接种后每日观察菌丝生长情况，直至其中1个处理中菌丝长满培养皿后停止观察，测量菌丝生长长度，计算菌丝生长速率[3]。菌丝生长速率（mm/d）=菌丝生长长度/培养天数
　　1.4 数据分析 数据用平均值±方差的方式表述。对各处理菌丝平均生长速率进行方差分析，用新复极差法进行多重比较和显著性分析（P<0.01为差异极显著，P<0.05为差异显著）[3]。 　　2 结果与分析
　　2.1 菌种鉴定结果 以野生侧耳菌株的DNA为模板，利用通用引物ITS1、ITS4进行PCR扩增，得到1条长度为651bp的序列（图1）。基于rDNA ITS碱基序列构建的NJ系统发育树（图2）表明，该野生侧耳菌株的ITS序列与 GenBank MG282476.1 Pleurotus columbinus （哥伦比亚侧耳）序列遗传距离最近，其次为GenBank MG282464.1  Pleurotus columbinus（哥伦比亚侧耳）。与GenBank KY962504.1 Pleurotus cornucopiae （cornucopia mushroom）（黄白侧耳）遗传距离稍远。与3株糙皮侧耳GenBank KY962480.1 Pleurotus ostreatus （oyster mushroom）、GenBank KY962440.1 Pleurotus ostreatus、GenBank KY96244
　　2.1  Pleurotus ostreatus （oyster mushroom） 遗传距离最远，初步鉴定该野生侧耳为哥伦比亚侧耳（Pleurotus columbinus）。
　　2.2 影响菌丝生长的因素
　　2.2.1 碳源 由表1可知，该野生侧耳菌株具有较广的碳源谱，6种供试碳源均能吸收利用，但在不同碳源培养基上，菌落形态、菌丝长势及生长速率有较大差异。其中，以蔗糖为碳源时效果最佳，菌落圆形、完整、致密，菌丝生长速率最快，为（10.32±0.07）mm/d;其次为淀粉、玉米粉、麦芽糖、葡萄糖，三者之间无显著差异;葡萄糖培养基中菌丝长势较弱，生长速率较慢，为（9.43±0.73）mm/d;果糖培养基中菌丝生长速率最慢。因此，在试验范围内确定蔗糖为最佳碳源。
　　2.2.2 氮源 由表2可知，该野生侧耳菌丝在不同氮源培养基中的长势及生长速率存在一定的差异。在牛肉膏培养基中菌落致密，长势最好，生长速率最快，为（10.37±0.18）mm/d;其次为酵母浸粉和蛋白胨，生长速率分别为（10.23±0.28）mm/d、（9.79±0.91）mm/d;在以上3种复合氮源培养基中菌落致密，三者间差异不显著，与其他氮源处理培养基差异极显著。菌丝在谷氨酸培养基中长势较好，菌落较致密，生长速率较快，为（9.18±0.20）mm/d，与其他差异显著。在硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾培养基中长势相对较差，其中硝酸钾培养基中生长速率最慢，三者间差异显著。在尿素培养基中未观察到菌丝生长。因此，培养该野生侧耳菌株氮源优选复合氮源，其中以牛肉膏效果最佳，其次为酵母浸粉和蛋白胨。
　　2.2.3 碳氮比 由表3可知，不同碳氮比对野生侧耳菌丝生长影响较显著，在试验范围内，菌絲培养阶段碳氮比为10∶1时菌丝长势最好，生长速率最快，为（9.61±0.42）mm/d。
　　2.2.4 pH 由表4可知，该野生侧耳菌丝适宜的pH值范围较广，在pH5.5～8.0范围内培养基中菌丝均可正常生长，pH6.0时野生侧耳菌丝生长速率最快，但与pH5.5和pH6.5时差异不显著，pH7.0～8.0时生长较差。因此，该野生侧耳菌丝更适宜在偏酸性培养基中生长，试验范围内其生长最适pH值为6.0。
　　2.2.5 温度 由表5可知，不同温度对该野生侧耳菌丝生长影响显著，其中25℃、30℃时菌丝生长最旺盛，低于25℃或高于30℃菌丝生长受到抑制。因此，在试验范围内该野生侧耳菌丝生长最适温度范围为25～30℃。
　　3 结论与讨论
　　哥伦比亚侧耳在分类学上归属一直不甚明确，郑和斌等通过rDNA ITS序列测序，认为哥伦比亚侧耳（Pleurotus columbinus）与灰白侧耳（Pleurotus spodoleucus）为同物异名[6];Singer根据形态、解剖特征、生理特性将侧耳分为6组，认为哥伦比亚侧耳是糙皮侧耳的变种[7];王呈玉通过对标本宏观和微观结构的观察，将哥伦比亚侧耳（Pleurotus columbinus）作为糙皮侧耳的1个生态型进行讨论[1]。本研究中通过观察NJ系统发育树，该野生侧耳的ITS序列与GenBank中编号为 MG282476.1的哥伦比亚侧耳（Pleurotus columbinus）序列遗传距离最近，鉴定该野生侧耳为哥伦比亚侧耳（Pleurotus columbinus），在NCBI中查询可知，该哥伦比亚侧耳属担子菌门（Basidiomycota），伞菌亚门（Agaricomycotina），伞菌亚纲（Agaricomycetidae）， 伞菌目（Agaricales）， 侧耳科（Pleurotaceae），侧耳属（Pleurotus）真菌。
　　通过平板培养法对该野生侧耳进行单因素试验，研究影响其菌丝生长的因素。不同碳源对菌丝生长有明显的影响，菌丝在蔗糖培养基中长势最佳、生长速率最快，其次为淀粉、玉米粉、麦芽糖培养基，再次为葡萄糖培养基，果糖培养基中最差，试验结果中蔗糖培养与常见葡萄糖培养对菌丝生长影响差异极显著。因此，优化培养基碳源应选择蔗糖。不同氮源处理对菌丝生长有明显的影响，菌丝在复合氮源（牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨）中长势最好、生长速率最快，可能是因为复合氮源中营养物质丰富，所含核苷酸类、矿物质类水溶性物质能够满足菌丝生长的营养需求。在无机氮源（硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵）中长势较弱，可能是因为无机氮源成分单一，不能有效提供菌丝合成蛋白质、核酸等含氮大分子的必需元素。菌丝在尿素培养基中无明显生长，可能是因为尿素培养基高温灭菌过程中产生了某种物质抑制菌丝生长。不同碳氮比处理对菌丝生长也有影响，碳氮比为10∶1时能满足菌丝生长对碳氮的要求，菌丝长势最好。在不同pH值环境下，菌丝在偏酸性培养基中长势良好。在不同温度情况下，菌丝在25～30℃培养基中长势良好。试验结果表明，该哥伦比亚侧耳（Pleurotus columbinus）菌丝生长最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为牛肉膏，最适碳氮比为10∶1，最适pH为6.0，最适培养温度范围为25～30℃。
　　参考文献
　　[1]王呈玉.中国侧耳属[Pleurotus（Fr.）Kumm.]真菌系统分类学研究[D].吉林：吉林农业大学，2004：1-96.
　　[2]高山.基于nLSUrDNA和ITS序列对侧耳属系统发育关系的研究[D].武汉：华中农业大学，2004：1-70.
　　[3]张国广，卢文朋，林溜章，等.一株野生有柄树舌的鉴定、菌丝培养特性及驯化栽培[J].北方园艺，2015（22）：153-157.
　　[4]王锋尖，周向宇，甘露.一株野生食用菌的形态及分子鉴定[J].北方园艺，2017（21）：159-162.
　　[5]宋冰，付永平，郭昱秀，等.一株野生侧耳属菌株的鉴定及生物学特性[J].北方园艺，2017（24）：182-188.
　　[6]郑和斌.核rDNA ITS序列在侧耳属分子分类学上的应用[D].武汉：华中农业大学，2005：1-43.
　　[7]Singer R.The Agaricales in Modern Taxonomy，4th edn.Koenigstein[J].Germany：Koeltz Scientific Books，1968，174-179.
　　（责编：张宏民）
　　基金项目：陕西省重点研发计划重点产业创新链项目（2017ZDCXL-NY-01-04）;陕西省重点研发计划一般项目（2017NY-021）。
　　作者简介：孙瑞泽（1990—），女，陕西渭南人，硕士，助理农艺师，从事食用菌、中药材等经济作物育种及栽培研究工作。  *通讯作者
　　收稿日期：2019-03-24
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