东北野生薄荷挥发油成分及抑菌活性研究

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　　摘要 [目的]研究东北野生薄荷的挥发油化学成分及抑菌活性。[方法]运用水蒸气蒸馏法提取挥发油，采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对挥发油化学成分进行分析。运用滤纸片琼脂板扩散法和二倍稀释法，对挥发油的抑菌活性和最小抑菌浓度进行研究。[结果]薄荷挥发油出油率为0.8%，通过运用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）鉴定出东北野生薄荷的挥发油成分有59种。提取出的薄荷挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等常用菌种均有抑制作用，且抑菌圈直径分别为10.92、10.25、9.18 mm，最小抑菌浓度分别为1.56、3.13、12.50 μL/mL。[结论]用GC-MS法检测出东北野生薄荷的挥发油化学成分较多，且挥发油表现出良好的抑菌活性，具有很大的市场潜力。
　　关键词 薄荷;挥发油;气相色谱-质谱联用技术;抑菌活性;抑菌圈;最小抑菌浓度
　　中图分类号 R284.1文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）10-0170-03
　　Abstract [Objective] The research aimed to study the chemical composition and antibacterial activity of the volatile oils from wild Mentha haplocalyx in Northeast China. [Method]GCMS was employed to analyze the composition of the volatile oil from Mentha haplocalyx extracted.The antibacterial activity and minimum inhibitory concentration of volatile oil were studied by using the paper agar diffusion method and double broth dilution method. [Result]The yield of volatile oil from Mentha haplocalyx was 0.8%. 59 main vo1atile compounds were identified by the gas chromatographymass spectrometry. The extracted volatile oil had an inhibitory effect on common strains such as Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Bacillus subtilis，and the diameter of the inhibition zone was 10.9，10.25 and 9.18 mm， respectively. The minimum inhibitory concentrations were 1.56， 3.13， 12.50 L/mL， respectively. [Result]Many chemical constituents of the volatile oil from wild Mentha haplocalyx in Northeast China were detected by GCMS. The volatile oil showed good antibacterial activity，so Mentha haplocalyx Briq may have great market potential.
　　Key words Mentha haplocalyx Briq.;Volatile oil;Gas chromatographymass spectrometry;Antibacterial activity;Inhibition zone;Minimum inhibitory concentration
　　薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）為唇形科植物，是一种有特种经济价值的芳香作物，是中华常用中药之一。我国的薄荷属植物主要分布于华东和东北等地区[1]。薄荷挥发油化学成分主要有薄荷醇、L-薄荷酮、胡薄荷酮、芳樟醇、香芹酚、α-松油醇和香芹酮等，且具有抑菌[2]、抗炎镇痛[3]、抗氧化[4]、抗病毒、祛痰、保肝利胆、抗早孕、促渗透等作用。目前，薄荷挥发油及其衍生品已广泛应用于医药、食品和化妆品等领域。国内外一些学者对薄荷属植物挥发油的化学成分以及对各种病原菌的抑菌活性进行了大量研究。靳有才等[5]对青海野生薄荷挥发油的成分进行了分析，共鉴定出42种化学成分。Rahman等[6]运用GC-MS检测出薄荷精油有29种化合物，同时表明精油对肺炎克雷伯菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、假单胞菌属等的抗菌活性具有较大的潜力。Singh等[7]通过琼脂扩散法评价了一些革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株，发现薄荷油具有强烈的抗菌和抗氧化活性，但需要进行额外的研究以确认最低抑菌浓度（MIC）。所以为了进一步探索国产野生薄荷挥发油的化学成分及其抑菌活性，笔者对黑龙江牡丹江地区野生薄荷的挥发油进行研究。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 仪器。
　　HP7890A-5975 型气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）;RE52A 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;SHB-循环式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;FA 2004电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）;FLC-3 生物洁净工作台（哈尔滨市东联公司）;立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司）;HPS-160生化培养箱（哈尔滨市东联电子公司）。 　　1.1.2 试剂。
　　正己烷、丙酮（分析纯，天津金汇太亚化学试剂有限公司）;正构烷烃对照品（C10～C20，上海西域机电股份有限公司）。
　　1.1.3 试材。
　　薄荷采自黑龙江省牡丹江地区，由佳木斯大学方洪壮教授鉴定，经室内干燥、粉碎后按中国药典挥发油测定甲法，提取挥发油，其油为淡黄色液体，得油率为0.8%。所得挥发油用无水硫酸钠脱水，供分析用。所用菌种为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，由东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室赵修华教授惠赠。
　　1.2 方法
　　1.2.1 挥发油提取。
　　取供试品药材50 g，粉碎后制成粗粉，用水蒸气蒸馏法提取挥发油。将挥发油溶液转移至旋转蒸发仪的蒸发瓶中，用正己烷洗涤无水硫酸钠，并入蒸发瓶中，在50 ℃下减压浓缩除去溶剂，得到具有浓郁香气的淡黄色透明液体，密封避光冷藏。
　　1.2.2 GC-MS分析条件。
　　1.2.2.1
　　色谱条件。HP-5MS 石英毛细管色谱柱，规格为 30 mm×0.25 mm×0.25 μm，进样口温度 280 ℃，接口温度 280 ℃;载气为高纯度氦气（99.99%），分流比为 100∶1，进样体积 1 μL。程序升温条件：初始温度60 ℃，以3 ℃/min升温至144 ℃，等温5 min;再3 ℃/min升温至254 ℃，280 ℃后运行10 min 。
　　1.2.2.2
　　质谱条件。标准EI源（70 eV），离子源温度为230 ℃，接口温度为280 ℃，四极杆质量分析器，扫描范围30～450 amu，扫描速度为3.42 scans/s。
　　1.2.3 体外抑菌试验。
　　1.2.3.1 样品制备。
　　将薄荷挥发油用丙酮混溶制成含量浓度为 100 μL/mL的混合溶液，用0.22 μm滤膜过滤除菌，备用。将培养至对数生长的3种菌种，以无菌生理盐水稀释制成含菌量约为1×106 CFU/mL的菌悬液，备用。
　　1.2.3.2 挥发油抑菌活性的研究。
　　采用滤纸片琼脂板扩散法测定挥发油的抑菌圈。吸取3种供试菌悬液100 μL分别涂布于琼脂培养基平板上。将直径为 6 mm 的无菌滤纸片浸于薄荷挥发油中 0.5 h。在无菌操作下，将滤纸片呈三角状贴于涂布了相应菌液的固体培养基平板，在恒温 37 ℃条件下培养 24 h。准确记录抑菌圈的直径，并设置丙酮阴性对照组和青霉素阳性对照组，每组平行 3次。
　　1.2.3.3 挥发油最低抑菌浓度（MIC）的测定。
　　采用二倍稀释法，将配制好的薄荷挥发油溶液进行浓度梯度稀释，加入到已经处理好的培养基中，混合均匀，并使浓度为25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 μL/mL;待培养基冷却凝固后，平板划线
　　接种，在恒温 37 ℃条件下培养 24 h。观察结果，以丙酮作为
　　对照，肉眼可见菌落生长者为无抑制作用，各组均平行3 次，以完全没有菌落生长的最低精油浓度为其最低抑菌浓度。
　　2 結果与分析
　　2.1 挥发油含量及化学成分分析
　　经水蒸气蒸馏法提取得到挥发油0.6 mL，出油率为0.8%。按照上述测试条件进行 GC-MS分析，得到薄荷挥发油的GC-MS 总离子流图（图1）。采用自动质谱解卷积定性系统（AMDIS）结合色谱保留指数（RI）定性化学成分，并用峰面积归一化法测定化学成分的相对含量。在设定的仪器条件与分析方法下，共鉴别出59种物质，占总含量的96.54%，其定性及定量结果见表1。薄荷挥发油主要成分有芳樟醇、月桂烯，含量分别为63.30%、3.68%，占总鉴定出物质的66.98%。另外，在鉴定出的物质中，有11种相对含量大于1%，它们分别是3-辛酮（含量为1.04%）、（Z）-β-罗勒烯（含量为2.10%）、顺-芳樟醇氧化物（含量为3.05%）、反-芳樟醇氧化物（含量为2.88%）、脱氢芳樟醇（含量为1.01%）、α-松油醇（含量为2.63%）、苯异戊酸（含量为1.12%）、香叶醇（含量为1.75%）、茴香脑（含量为2.37%）、丁香酚（含量为2.07%）、石竹烯（含量为2.44%）。
　　2.2 挥发油抑菌活性测定
　　薄荷挥发油对不同菌株均有一定的抑制作用，对不同菌株的抑菌圈大小见表2。由表2可知，薄荷挥发油对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用最强，抑菌圈直径为10.92 mm，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌也有明显的抑菌作用，抑菌圈直径分别为10.25、9.18 mm。
　　2.3 挥发油最小抑菌浓度测定
　　不同浓度的薄荷挥发油对不同的菌株均有不同程度的抑制作用，抑菌结果见表3。其中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为1.56、3.13、12.50 μL/mL，表明薄荷挥发油的抑菌作用与浓度相关，浓度太低抑菌效果就会变差。
　　3 结论与讨论
　　经水蒸汽蒸馏法提取薄荷挥发油，利用GC-MS联用技术从薄荷挥发油中鉴定的化学成分数为59个，主要成分有芳樟醇、月桂烯，含量分别为63.30%、3.68%，与新疆薄荷[8]、湖南永州薄荷[9]主要成分以及含量有所区别，可能是地域不同薄荷挥发油的主要成分也有区别。利用滤纸片琼脂板扩散法和二倍稀释法，测得东北野生薄荷对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等常见菌种具有良好的抑菌活性，此结果与Reddy等[10] 发现精油对金黄色葡萄球菌、黄色微球菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌等具有较高的抗菌活性结果相似，但浓度太低将不能达到最好的效果。这为东北野生薄荷资源的开发提供了依据，有助于东北薄荷在药用食用等方面的进一步推广应用。 　　参考文献
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　　[4] 杨倩.薄荷挥发油的化学型分析及抑菌、抗炎活性研究[D].镇江：江苏大学，2017.
　　[5] 靳有才，庆易薇，郭珍.青海野生薄荷挥发油成分GC-MS分析[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（23）：143-146.
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　　[8] 孫亚栋，阿布力米提·阿布都卡德尔.薄荷叶挥发油成分的GC-MS分析[J].新疆大学学报（自然科学版），2017，34（1）：61-63.
　　[9] 田祎穎，姚婷，黄光文，等.湖南永州薄荷挥发油化学成分GC-MS分析[J].山东化工，2018，47（15）：96-97.
　　[10] REDDY D N，ALRAJAB A J，SHARMA M，et al.Chemical constituents，in vitro antibacterial and antifungal activity of Mentha × Piperita L （peppermint）essential oils[J/OL].Journal of King Saud UniversityScience，2017[2018-11-20].doi：http：//dx.doi.org/10.1016/j.jksus.2017.07.013.
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