丁香总黄酮抗氧化活性研究

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　　摘要：以2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）对照品、槲皮素对照品和丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）挥发油为对照，对丁香总黄酮还原力、清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·自由基）能力进行了评价。结果表明，丁香总黄酮有较好的抗氧化活性，其还原力略低于阳性对照BHT而高于丁香挥发油，清除DPPH·自由基能力则随浓度增大明显增强，浓度达到0.15、0.20 mg/mL时，其DPPH·自由基清除率分别超过丁香挥发油和阳性对照BHT。
　　关键词：丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）;总黄酮;抗氧化活性
　　中图分类号：S567.1+9         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）09-0117-03
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.028           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： The antioxidant activity of total flavonoids from Caryophylli flos was studied with 2，6-tert butyl-4-methyl phenol （BHT）， quercetin， and essential oil from Caryophylli flos as reference， and the total reducing capacity and scavenging DPPH· free radical ability as evaluating indicator. The total flavonoids of Eugenia Cargophyllata Thunb. had better antioxidant activity，and its reducing power was slightly lower than that of positive control BHT and higher than that of essential oil from Caryophylli flos. The DPPH· free radical scavenging capacity increased obviously with the increase of concentration. When the concentration reached 0.15 and 0.2 mg/mL，DPPH· radical scavenging rate exceeded essential oil from Caryophylli flos and positive control BHT respectively.
　　Key words： Eugenia Caryophyllata Thunb.; total flavonoids; antioxidant activity
　　丁香又稱公丁香、丁子香等，系桃金娘科植物丁香（Eugenia Caryophyllata Thunb.）的干燥花蕾，花蕾由绿转红时采摘，为2015年版《药典》收载品种。其味辛，性温，归肝、肾、脾、胃经，有温阳散寒、理气止痛的功效[1]，为良好的芳香健胃剂[2]，主治呃逆、呕吐、反胃等症。丁香作为一种药食两用中药[3]，已被收入《既是食品又是药品的物品名单》，其资源丰富，是中国传统进口“南药”之一[4]，喜热带海洋性气候，主要产于一些热带地区，如坦桑尼亚、印度尼西亚等地区[5]，因其具有极高的药食两用价值，中国海南、广东、广西、云南等沿海热带地区也相继引种栽培，并获得成功。丁香化学成分复杂，主要含有挥发油、黄酮、有机酸等成分[6]，黄酮类成分通常具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤以及增强免疫力等广泛的药理活性[7]。
　　目前，丁香的主要研究热点是其挥发油[8]，尤其是丁香酚，其含量、药理活性及其相关研究已较为透彻，对其他成分的研究报道则较少，现行《中国药典》也仅对丁香酚这一活性成分作了定性和定量研究[1]，而作为一个复杂的整体，在活性成分上仅以一种成分来进行质量控制，说服力不足，也不能较好诠释中药用药特点。黄酮类成分通常有较好的抗氧化活性，而丁香总黄酮含量较高，含有槲皮素[9]、山奈酚、鼠李素[10]及苷类等黄酮类化合物，具有潜在的开发价值。对丁香总黄酮进行抗氧化活性研究，以期为丁香总黄酮更进一步的研究及应用奠定基础。
　　1  材料与方法
　　1.1  仪器
　　中药材粉碎机（FW177，天津泰斯特仪器有限公司）;电子分析天平（CP225D，北京赛多利斯天平有限公司，d=0.01 mg）;恒温水浴锅（XMTD-2M，天津泰斯特仪器有限公司）;紫外-可见分光光度计（UV-3200，上海美谱达仪器有限公司）;旋转蒸发仪。
　　1.2  试剂
　　丁香药材，经湖北中医药大学生药教研室鉴定为桃金娘科植物丁香的干燥花蕾;丁香总黄酮粉末为实验室自制;2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚对照品（BHT），Sigma-Aldrich公司;槲皮素对照品、丁香挥发油、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·），Sigma-Aldrich公司;无水乙醇、二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、六水合三氯化铁为分析纯，国药集团;三重蒸馏水。
　　1.3  方法
　　1.3.1  供试品溶液的制备  分别取丁香总黄酮粉末、BHT对照品、槲皮素对照品和丁香挥发油50 mg，精密称定，加乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成浓度为0.5 mg/mL的供试品溶液，分别作为总黄酮储备液、BHT储备液、槲皮素对照品储备液和丁香挥发油储备液。 　　1.3.2  试剂的配制
　　1）磷酸盐缓冲液。称取十二水合磷酸氢二钠7.16 g、二水合磷酸二氢钠3.12 g，分别加三重蒸馏水溶解并定容至100 mL，再分别取适量磷酸氢二钠、磷酸二氢钠溶液，混合均匀，二者占比分别为62.5%、37.5%，即得pH为6.6的磷酸盐缓冲液（PBS），备用。
　　2）铁氰化钾溶液。称取1.00 g铁氰化钾粉末，加三重蒸馏水定容至100 mL，即得1%铁氰化钾溶液，备用。
　　3）三氯乙酸溶液。称取10.00 g三氯乙酸样品，加三重蒸馏水定容至100 mL，即得10%三氯乙酸溶液，备用。
　　4）三氯化铁溶液。称取0.17 g六水合三氯化铁样品，加三重蒸馏水定容至100 mL，即得0.1%三氯化铁溶液，备用。
　　5）DPPH·溶液。取DPPH·标准品25 mg，精密称定，加无水乙醇溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度为0.5 mg/mL的DPPH·溶液，避光冷藏备用。
　　1.3.3  还原力测定  取10 mL EP管，依次加入2.0 mL PBS溶液、2.0 mL不同浓度总黄酮溶液（以总黄酮储备液稀释，浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL）、2 mL 1%铁氰化钾溶液，混合均匀，于50 ℃恒温水浴中保持20 min，再向EP管中加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀并离心。吸取上清液4 mL于另一10 mL EP管中，依次加入4 mL三重蒸馏水、1 mL 0.1%三氯化铁溶液，混合均匀，10 min后用紫外-可见分光光度计于710 nm处测定反应液吸光度，并以三重蒸馏水替代总黄酮溶液作为空白对照，以BHT、槲皮素对照品和丁香挥发油为对照。
　　1.3.4  清除DPPH·自由基能力测定  取10 mL EP管，依次加入2.0 mL不同浓度的总黄酮溶液（以总黄酮储备液稀释，浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL）、2 mL DPPH·溶液，并用无水乙醇稀释至10 mL，混合均匀测吸光度A1。再取10 mL EP管，加入2 mL DPPH·溶液，用无水乙醇稀释至10 mL，混合均匀测吸光度A0。向另一EP管中依次加入2 mL不同浓度总黄酮溶液，用无水乙醇稀释至10 mL，混合均匀，作为空白对照，静置30 min后，用紫外-可见分光光度计于517 nm处测定反应液吸光度A2，并以BHT、槲皮素对照品和丁香挥发油为对照。DPPH·自由基清除率计算公式为：
　　2  结果与分析
　　2.1  还原力
　　反应液吸光度与丁香总黄酮还原力正相关，吸光度越大表明还原力越强（图1）。从图1可以看出，4种供试样品均有一定的还原力，相比于阳性对照BHT，丁香总黄酮还原力与其相当，仅稍微低于BHT。槲皮素对照品还原力要远高于丁香总黄酮，在4种供试样品中还原力最强，丁香挥发油还原力则略低于丁香总黄酮，4种供试样品还原力強弱顺序为槲皮素对照品>BHT>丁香总黄酮>丁香挥发油。
　　2.2  清除DPPH·自由基能力
　　DPPH·自由基清除率结果见图2。由图2可以看出，4种供试样品均有一定清除DPPH·自由基的能力，样品浓度越大，其DPPH·自由基清除能力越强，随样品浓度的增大，4种供试样品清除DPPH·自由基能力逐渐接近。当样品浓度为0.05 mg/mL时，4种供试样品清除DPPH·自由基能力差异较大，丁香总黄酮清除率最低，仅为27.73%，其次为丁香挥发油36.41%、BHT 56.44%，清除率最大的为槲皮素对照品79.03%。样品浓度对丁香总黄酮清除DPPH·自由基的影响较大，当浓度达到0.15 mg/mL时，丁香总黄酮对DPPH·自由基的清除率超过丁香挥发油，二者清除率分别为74.82%、72.13%;而当浓度达到0.20 mg/mL时，丁香总黄酮对DPPH·自由基的清除率与阳性对照BHT相当，浓度高于0.20 mg/mL后，清除率比BHT高，并逐渐与槲皮素对照品的清除率相当，当样品浓度达到0.30 mg/mL时，丁香总黄酮与槲皮素对照品对DPPH·自由基的清除率分别为94.39%、94.81%。
　　3  小结与讨论
　　试验对丁香总黄酮的还原力和清除DPPH·自由基的能力进行了测定、评价，还原力的测定主要依据文献条件[11]，并在此条件下对样品浓度进行了考察，发现总黄酮浓度为1.0、0.5 mg/mL时，最终测出的吸光度过大，且此时槲皮素对照品吸光度已超出量程，故进一步减小浓度至0.3 mg/mL，吸光度在量程范围内且保持较高水平，因此最终选定样品浓度梯度在0.05～0.30 mg/mL。在测定DPPH·自由基清除能力时，为保证样品浓度梯度与测定还原力时一致，考察了DPPH·自由基的浓度，当其浓度为0.079 mg/mL时，在浓度梯度范围内样品均有很强的清除能力（测定方法为2 mL样品溶液与2 mL DPPH·溶液混匀测定），进一步查阅文献加大浓度至0.50 mg/mL，以同样方法测定，发现在一定浓度下其吸光度超过仪器量程，即清除率极低，故将反应液稀释（测定方法为2 mL样品溶液与2 mL DPPH·溶液混匀，并用无水乙醇稀释至10 mL），结果较好，因此最终采用所选方法进行测定。
　　试验以BHT为阳性对照，对比槲皮素对照品、丁香挥发油，对丁香总黄酮还原力、清除DPPH·自由基能力进行测定，并以此评价其抗氧化活性。在所用条件范围内，丁香总黄酮有较好的抗氧化活性，其还原力略低于阳性对照BHT而高于丁香挥发油，清除DPPH·自由基能力则随浓度增大有明显的增强趋势，浓度达到0.15、0.20 mg/mL时，其DPPH·自由基清除率分别超过丁香挥发油和阳性对照BHT。本研究对丁香总黄酮抗氧化活性进行了评价，将为丁香作为一种天然抗氧剂的开发奠定基础。
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　　收稿日期：2018-10-25
　　基金项目：湖北省技术创新重大项目（2016ACA146）
　　作者简介：黄晶玲（1995-），女，湖北潜江人，在读硕士研究生，研究方向为中药及其制剂的物质基础研究，（电话）13554673864（电子信箱）893157438@qq.com;通信作者，江汉美（1964-），教授，主要从事中药及其制剂的物质基础研究，（电子信箱）13807186811@163.com。
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