紫外分光光度法测定半枝莲中总黄酮的不确定度评定
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【摘 要】目的：以野黄芩苷对照品，以甲醇为空白，用紫外分光光度法，在335mn的波长处分别测定半枝莲中总黄酮含量。通过对操作各环节不确定度分量进行分析量化，评定半枝莲中总黄酮的不确定度[1]。
【关键词】紫外分光光度法;总黄酮;不确定度评定
【中图分类号】R282.2 【文献标识码】A 【文章编号】1005-0019（2019）11-0-01
1 仪器与试剂
1.1 仪器：紫外-可见光分光光度计，珀金埃尔默仪器公司 Lambda850型
1.2 黄芩苷对照品：中国食品药品检定研究院，编号：110842-201508.
2 实验方法和条件
2.1 实验操作
2.1.1 供试品溶液的制备：取约lg的半枝莲粉末（过三号筛）精密称定，放在索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）提取至无色，弃去醚液，葯渣挥去石油醚，加甲醇继续提取至无色，转移至100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.1.2 对照品溶液制备：取适量野黄芩苷精密称定，加甲醇制成每lml含0.2mg的溶液，即得。
2.1.3 标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml分别置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇勾。以甲醇为空白，照紫外-可见分光光度法，在335mn的波长处分别测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2.2 实验条件：实验室温度（20±5℃）;采用分度为0.0001g天平称量。
3 结果与分析
3.1 被测量的数学模型Xi=
式中：Xi为供试品中总黄酮的含量/（%）; 为测定用样液中总黄酮的质量/mg，m为供试品质量/g;V1为测定用样液体积，V0为供试品处理液总体积/mL.
3.2 不确定度来源 从测量过程和被测量的数学模型分析，半枝莲中总黄酮含量测定的不确定度主要来源于测量用样液中总黄酮的含量、对照品的纯度、对照品、供试品的称量，测定用样液移取体积、温度效应和重复性等因素。其中测量用样液中总黄酮质量的不确定度包括两个方面：一标准曲线拟合的不确定度;二是配置对照品溶液产生的不确定度，这其中又包括由对照品引入的不确定度、称量产生的不确定度、对照品溶液配制过程中量器校准产生的不确定度。
3.3 分析和量化不确定度
3.3.1 测量用样液中总黄酮质量的不确定度
3.3.1.1 标准曲线拟合的不确定度
标准曲线拟合的标准不确定度是通过对标准系列重复两次测量获得的。
根据结果，用最小二乘法拟合标准曲线，得回归方程y=0.0253x-0.0038，相关系数r=0.9994，其中设曲线斜率为0.0253，截距A=0.0038，对供试品样液中总黄酮含量进行2次测定，结果分别为12.2g/100g和12.4g/100g，平均值为12.3g/100g。测定样液质量浓度C的不确定度：
3.3.2对照品溶液的配制不确定度
3.3.2.1对照品称量的Ws（mg）的不确定度分量u（Ws）
野黄芩苷对照品称量为Ws10.00mg，试验用天平由校准证书查到其最大允差为±0.2%，则称量最大差值为0.2mg，换算成标准不确定度为=0.1155（mg）;因为称重2次，1次为皮重，1次为总重，则u（Ws）=（2×0.11552）=0.1633（mg），其相对不确定度为=1.63×10-2
3.3.2.2 对照品纯度Ps（%）的不确定度分量u（Ps）%
野黄芩苷对照品纯度P=100.0%±1.0%计算。按矩形分布计算标准不确定度u（Ps）为：u（Ps）==0.005774
3.3.2.3 对照品溶液及取液体积的不确定度u（Vs）
对照品溶液配制需要用1个容量瓶（25ml），根据JJG196-2006常用的玻璃容量25ml容量瓶的容量允许误差为±0.03ml，按矩形分布k=，0.03/=0.017ml，温度变化引入的不确定度：温差为5℃，水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1体积变化为25×2.1×10-4℃-1×5=0.0263ml，按矩形分布，0.0263/=0.0152ml。两项分量不确定度平方和的平方根除以容量瓶体积，得到25ml容量瓶引入的相对不确定度为urel（V25）=9.1×10-4.
对照品溶液系列配制，需要用到5个25ml容量瓶，它们的容量允许误差为±0.03ml，按照矩形分布，0.03/=0.017ml。温度变化引入的不确定度：体积变化为25×2.1×10-4℃-1×5=0.0263ml，按矩形分布，0.0263/=0.0152ml两项分量不确定度平方和的平方根除以容量瓶体积，得到25ml容量瓶引入的相对不确定度为urel（V25）=9.1×10-4.
移液器引入的不确定度
用0.2-1.0ml移液器移取对照品溶液进行标准溶液的制备，它的容量允许误差为±0.010ml，按照矩形分布0.010/=0.0058ml（k=3）.温度变化引入的不确定度=V（2.110-4℃-1×5/ ），其中V为吸取对照品溶液的体积。
移液器引入的合成不确定度为各个体积分量引入的相对不确定度的平方和的平方根，结果为urelV=1.76×10-2
3.3.2.4 由对照品称量、配置曲线等引入的合成不确定度为=0.0247
3.3.3 由供试品引入的合成不确定度
3.3.3.1 由供试品称量引入的不确定度
供试品称量为Ws1.0g，试验用天平由校准证书查到其最大允差为±0.2%，则称量最大差值为0.2mg，换算成标准不确定度为=0.1155（mg）;因为称重2次，1次为皮重，1次为总重，则u（Ws）=（2 0.11552） =0.1633（mg），其相对不确定度为=1.63 10-2
3.3.3.2 供试品制备引入的不确定度
供试品溶液配制需要用到1个100ml的容量瓶和1个50ml，根据JJG196-2006常用的玻璃容量中查到，100ml，50ml容量瓶的容量允许误差为±0.10ml、±0.05m，按矩形分布k=，0.10/=0.058ml、0.05/=0.029ml，温度变化引入的不确定度：温差为5℃，水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1体积变化为25×2.1×10-4℃-1×5=0.0263ml，按矩形分布，0.0263/=0.0152ml。两项分量不确定度平方和的平方根除以容量瓶体积，得到100ml容量瓶引入的相对不确定度为urel（V100）=6.0×10-3，两项分量不确定度平方和的平方根除以容量瓶体积，得到50ml容量瓶引入的相對不确定度为urel（V100）=6.5×10-4。
由供试品制备引入的相对不确定度=6.0×10-3
3.3.3.3 供试品引入的合成不确定度=0.01
3.4 合成不确定度 在整个测试过程中，不确定度来自测量重复性，工作曲线拟合，对照品溶液的配制，溶液定容、移取体积以及供试品称量等的不确定度。测定结果的不确定度应利用以上各分量的相对不确定度来进行合成。
3.5 扩展不确定度：取包含因子k=2，扩展不确定度=0.054×2×12.3=1.33g/100g
3.6 不确定的报告：半枝莲中总黄酮的测定含量为（12.3±1.33）g/100g ，k=2
参考文献
范菊娣，覃容贵，张珏，等.主成分和聚类分析法对不同产地半枝莲的综合质量评价[J].2016，（23）：40-44.doi：10.13422/j.cnki.syfjx.2016230040.
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