药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
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摘 要：大肠埃希菌在4°中贮藏，其作为实验菌的活性。连续31天进行大肠埃希菌计数和特征实验，进而验证其数量及性状的稳定性。结果表明，在连续31天的实验中，大肠埃希菌的菌落数范围在1.5×109cfu/ml～8.7×109cfu/ml，且菌落大小、形态特征、指示反应等情况均体现出该菌种应有特性。实验证明，在4°冰柜贮藏条件下，大肠埃希菌能够作为对照菌进行控制菌检查法实验。
关键词：大肠埃希菌;贮藏;研究
中图分类号：R927 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2019）11-0175-02
Abstract： Escherichia coli（E. coli） was stored at 4° as an experimental bacterium. The counting and characterization experiments of E. coli were carried out for 31 consecutive days to verify the stability of its quantity and character. The results showed that the colony number of Escherichia coli ranged from 1.5×109cfu/ml to 8.7×109cfu/ml for 31 consecutive days， and the colony size， morphological characteristics and indicative reactions all reflected the proper characteristics of the strain. The results showed that E. coli could be used as control bacteria in the control bacteria test under 4° storage condition.
Keywords： Escherichia coli （E. coli）; storage; study
依据《中华人民共和国药典》2015版，非无菌产品微生物限度检查中的控制菌检查法，需进行阳性对照试验，每次试验均需要加入不大于100cfu的对照菌[1]。依据药典指导原则，菌种可采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于-30℃）等保存方法。使用以上方法保存菌种，则需在每次实验前都要进行菌种活化和计数实验，进而配制不大于100cfu的加菌量。本公司药品均进行微生物限度检查，其中含有大肠埃希菌项目。为提高检验效率，寻找适宜的菌种贮藏方法，同时结合本实验室实际情况，将大肠埃希菌经复苏后接种至胰酪大豆胨液体培养基中，24h菌种活化后，4°C冰柜里贮藏。随后每日进行菌种数量及性状验证，为进行大肠埃希菌的贮藏提供有益的科学探讨。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
BPX-272 型电热恒温培养箱由上海博迅医疗设备厂生产;YSQ-LS-75SII型立式压力蒸汽灭菌器由上海博迅医疗设备厂生产;1300系列A2型生物安全柜由赛默飞生产;大肠埃希菌[CMCC（B）44102]购自中国食品药品检定研究院;实验所用培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2 实验方法
1.2.1 菌液制备：复苏后的大肠埃希菌菌种（不超过5代）移至胰酪大豆胨液体培养基置培养箱中30～35°C培养24h，培养后贮藏至4°C冰柜。
1.2.2 菌种计数：取1ml菌液用pH7.0蛋白胨缓冲液逐级稀释至10-10，取各级稀释菌悬液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45°C熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。30～35°C培养24h，然后计数。
1.2.3 性状验证：10-8稀释级菌液大肠埃希菌接种于麦康凯液体培养基（42～44°C培养24h）和麦康凯琼脂培养基（30～35°C培养24h）中，观察培养基上大肠埃希菌生长情况。
2 实验结果
2.1 菌种计数实验结果
由表1可以看出，大肠埃希菌在4°C冰柜里贮藏，连续31天的菌落数范围在1.5×109cfu/ml～8.7×109cfu/ml之间。
2.2 性状验证实验结果
由表2可以看出，大肠埃希菌在4°C冰柜里贮藏，连续31天取菌液量均不大于100cfu，加入麦康凯液体培养基和麦康凯琼脂培养基中，培养基体现的菌落大小、形态特征、指示反应等情况均体现出大肠埃希菌应有特性（+表示）。
综上，将大肠埃希菌在4°C冰柜里贮藏，连续31天进行计数和性状实验。结果表明，取10-8稀释级菌液，每ml菌液量均不大于100cfu，这可用于大肠埃希菌检测阳性对照试验的加菌量，无需每次进行验证。同时，每ml10-8稀释级菌液也能够表现出大肠埃希菌應有特性。由此证明，每次进行大肠埃希菌实验，可直接用贮藏菌液稀释至10-8，取1ml作为阳性对照实验的加菌量。
3 讨论
药品微生物限度检查是控制药品质量的一个重要检查项目，其中控制菌检查是必须进行的检验项目。控制菌检查过程中，需要添加不大于100cfu阳性菌进行阳性对照实验。按照冷冻法活化新鲜菌种，进而制备试验菌，其工作量较大，周期较长。现采用4°C冰柜贮藏大肠埃希菌菌液，每次可以直接进行稀释使用，提高工作效率，同时也可保障检验的顺利进行。本文只对大肠埃希菌进行实验，其他菌种（铜绿假单胞菌、沙门菌等）未进行相关实验，故是否能应用于所有控制菌实验还需进一步研究。
参考文献：
[1]中华人民共和国药典（四部）[M].2015.
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