细菌内毒素检查法中凝胶法在药品中的应用及经验总结
来源:用户上传
作者:
摘 要：本文主要介绍细菌内毒素检查法中凝胶法的原理、操作及注意事项，因凝胶法实验过程时间短，消耗样品量少，且使用设备简单，费用低等优点，并作为《中国药典》“仲裁”检查方法，广泛用于注射剂药品细菌内毒素检查。
关键词：细菌内毒素;凝胶法;注射剂药品
细菌内毒素作为外源性致热原的内毒素能激活中性粒细胞等，是革兰阴性菌细胞壁个层上的特有结构，会使中性粒细胞释放一种叫内源性热原质的物质，其在体温调节的中枢会引起发热反应。当内毒素经消化道进入人体不会产生危害，但内毒素经注射液等方式进入血液时则引起症状不同的疾病。因此，药品安全性检验一个重要项目就是药品注射剂中细菌内毒素检查。美国科学家Levin和Bang1968年建立鲎试验法来检查细菌内毒素，美国FDA于1973年制定的规则指出“鲎试剂是一种检测细菌内毒素的灵敏指示剂。”
1 鲎试剂的特性及与内毒素产生反应的作用机理
鲎试剂是细菌内毒素检查法中最重要的试剂。它是鲎科血细胞（变形细胞）裂解液的冻干产物。鲎的血液中只有一种类型的血细胞参与循环就是被称为变形细胞。目前制备细胞鲎试剂一种是东方鲎，另一种是美洲鲎。研究鲎试剂作用机理表明，细菌内毒素激活鲎试剂中鲎血细胞溶解物，产生一系列的凝集酶反应，形成凝固蛋白凝胶。判断供试品中细菌内毒素的限量能否在规定范围，可通过用鲎试剂检测，或者是量化革兰阴性菌所产生细菌内毒素。
2 细菌内毒素检查法
2.1内毒素标准品
细菌内毒素国家标准菌株由大肠杆菌提炼精制而成，是用来检查，校准，仲裁鲎试剂灵敏度、细菌内毒素浓度测定，干扰测试和测试方案中供试品阳性对照和阳性对照溶液的制备和光度测定方法的可靠性测试、凝胶检查鲎试剂试验敏感性。国家标准是细菌内毒素校准的参照标准，单位为内毒素（EU），1EU等于1國际单位内毒素（IU）。
2.2 实验准备
玻璃器皿在酪酸洗液、其他热源性灭活剂、或清洗剂将充分浸泡，控干洗液后用蒸馏水3遍以上的冲洗，放入干燥箱，在250℃干烤30min以上，用以除掉可能性存在外源性内毒素干扰。如果用塑料的器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
2.3 鲎试剂灵敏度复核
将细菌内毒素采样标准品与专门的检查水在涡流搅拌器中混合溶解15min，稀释后测定鲎试剂的灵敏度值（λc）。每一批新批次鲎试剂全部需严格采用灵敏度试验。
2.4 实验方法
将8支鲎试剂分别加入细菌内毒素检查用0.1mL水溶解。按最大稀释倍数稀释的供试品溶液0.1mL加入2支，作为供试品溶液管，2支加入含内毒素浓度为2λ对照溶液为供试品阳性对照管，2支加入2λ内毒素工作标准品溶液0.1mL作为阳性对照管，2支加入细菌内毒素检查用水0.1mL作为阴性对照管。试管混匀封口置于37℃±1℃恒温器中保温60分钟±2分钟，从恒温器中慢慢取出，极缓的倒转180°，若未形成凝胶，或者形成凝胶不坚实、变形体从管壁下滑脱落为阴性;管内出现凝胶并且凝胶不变形、如果不从管壁下滑脱落即为阳性。拿取或者保温试管时要避免振动，以免出现假阴性检测结果。
2.5实验注意事项
准备工作：肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒。应在清洁环境中进行操作，取样时防止混入气体，并防止微生物污染移液管。
3 干扰试验的必要性
鲎试剂凝聚反应是一种二价阳离子酶反应体系，有许多干扰反应的物质会干扰凝胶的形成。在新样品测定中，必须首先进行细菌内毒素干扰试验，确定是否存在干扰样品出现缩合反应的因素。为了保证所选处理方案能够在不灭活内毒素情况下有效消除干扰，采用预先添加的标准内毒素再处理液进行干扰试验。
4 可能会出现的异常结果及其原因和解决方法
4.1 造成呈假阴性的可能原因及解决方法
原因可能是：①内毒素工作标准中存在的一些问题，如滴度标注不准确，过期或贮存不当导致失效，稀释误差或稀释振荡不够，对照管没有达到2λ阳性内毒素浓度;②问题出在鲎试剂。例如，过期失效，振荡不当，灵敏度标注不准确，会产生气泡，鲎试剂酶蛋白变性，鲎试剂破坏;③温控器温度不符合要求或保温时间不够。
解决办法包括：规范内毒素标准效价的审查和鲎试剂在保质期正确储存和使用的敏感性;内毒素稀释应准确，确保PC管添加2λ内毒素;当使用可溶解的鲎试剂时，沿着管壁慢慢加水，让混合器振荡30s。避免剧烈振动产生气泡，确保恒温器温度和保温时间正确。
4.2 造成假阳性的可能原因及解决方法
原因可能包括：实验设备受到污染，经热原、外源性内毒素或微生物污染不能完全灭活;试验中由于误操作造成的内毒素污染;BET水不符合要求，内毒素超标，培养温度不正确等。解决方案包括：按照2015年版《中国药典》的规定对实验仪器进行处理;选择合格的BET水，确保正确的培养温度、时间和操作。
总而言之，细菌内毒素检查法已被列入许多国家药典。方法学研究表明，用细菌内毒素法取代家兔热原法的药物种类较多，因为它比家兔热原法更精准、快速、简捷、经济、容易推广等诸多优点。
参考文献：
[1]肖贵南，孙清萍，盛英美，等。如何建立新药的细菌内毒素检查方法[J].中国医药导报，2011，8（32）：159-160.
[2]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范（四部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.
[3]国家药典委员会.中国药典分析检测技术指南[M].北京：中国医药科技出版社，2015：614-620.
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-14890765.htm
