印度南瓜‘贝栗7号’杂交种子纯度SSR分子标记鉴定

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　　摘 要： 为了准确和快速地鉴定南瓜品种杂交种纯度，建立‘贝栗7号’南瓜品种的SSR分子标记纯度鉴定体系。基于24对南瓜SSR特异性引物对‘贝栗7号’品种亲本进行引物筛选，筛选出4对可扩增出差异片段的引物，再与F1代扩增出的片段进行对比，获得2对最优引物。最后通过大田和室内2种鉴定方法，对同一批次样本开展鉴定试验，结果表明，室内分子鉴定与大田鉴定符合率达99.97%，成功开展了鉴定技术的应用。
　　关键词： 印度南瓜; SSR; 纯度鉴定
　　中图分类号： S642.1   文献标志码： A   文章编号： 1673-2871（2020）02-037-05
　　SSR molecular marker identification hybrid seed purity of Indian pumpkin variety ‘Beili No. 7’
　　DENG Zhugen， XIA Weiwei， XU Tiantian， XIE Zhao， DAI Wei
　　（Anhui Jianghuai Hortriculture Seeds Co.， Ltd.， Hefei 230031， Anhui， China）
　　Abstact： In order to accurately and quickly identify the purity of pumpkin hybrids， a SSR molecular marker purity identification system for ‘Beili No. 7’ pumpkin variety was established. Based on 24 pairs of pumpkin SSR-specific primers were used to screen the parents of the ‘Beili No. 7’ variety， and four pairs of primers that amplified the differential fragments were screened， and then compared with the fragments amplified by the commercial F1 generation to obtain two optimal primer. Finally， the molecular identification and field identification rate reached 99.97%， suggesting the molecular method could be applied in identificaton of purity of ‘Beili No. 7’.
　　Key words： India pumpkin; SSR; Purity identification
　　印度南瓜（Cucurbita maxima Duch.）屬于葫芦科南瓜属，又名栗味南瓜，它外形美观、品质优良、熟果软糯有栗香，并且营养丰富，维生素A和维生素C含量极高，还含有微量元素钴（Co），对预防和治疗糖尿病、降低血糖有独特的疗效[1]。但印度南瓜的抗性差，不耐湿热[2]，而人们又喜爱其口感，这就要求育种工作者培育出兼具抗性好、适应性强、口感极佳的印度南瓜新品种。‘贝栗7号’品种就是针对市场需求选育出的兼具抗性和口感的优良品种。为了种子尽早进入市场，如何快速开展纯度鉴定工作就显得尤为重要。传统的田间鉴定方法不仅所需时间长、易受外在气候等环境因素的影响，又对鉴定人员的专业要求较高，受主观因素影响很大。而利用SSR分子标记鉴定技术可以解决这一难题。
　　SSR（Simple sequence repeat）分子标记，具有重复性好、稳定性高、多态性丰富、在全基因组序列中分布广泛等特点，相较于AFLP、RAPD、SRAP等技术，操作更简单、成本低廉[3]。与传统的田间鉴定相比，其不受天气影响和时间、空间限制，可以随时随地快速对样本进行室内检测鉴定。如今SSR分子标记已普遍应用于水稻、甜瓜、玉米等[4-6]作物品种的纯度鉴定、植物遗传多样性分析[7-9]以及遗传图谱建立等方面[10-12]。同时利用SSR分子标记技术对西洋南瓜的相关研究也已有不少的报道，周秦等[13]利用26对SSR引物分析26份南瓜品种的遗传多样性，可以将南瓜品种分为2大类，基本与可追溯的系谱信息一致;王瑞等[14]利用32对SSR引物能将95份南瓜品种分为中国南瓜、印度南瓜和美洲南瓜3个类群，并发现中国南瓜的遗传变异性高，种内基因差异丰富。同时朱海生等[15]对美洲南瓜进行转录组测序分析，利用35对引物对28份美洲南瓜进行聚类分析，可以将不同皮色外观的美洲南瓜区分出来。张国裕等[16]利用南瓜EST 数据，开发出了43对 EST-SSR 标记，利用这些引物鉴定了不同南瓜品种的纯度，并与田间种植数据进行了对比，发现两种检测方法有很高的一致性。韩小霞等[17]也利用33对SSR引物对2种南瓜杂交品种及其亲本进行纯度鉴定，并与田间形态鉴定结果对比分析发现两种结果成极显著相关关系。
　　笔者利用SSR分子标记技术，参考以上文献，合成了162对引物对，在多个品种上精选出24对区分性好、差异大的引物，作为核心检测引物。用24对引物对‘贝栗7号’的亲本进行引物筛选，找到可以鉴定‘贝栗7号’杂交种纯度的引物，并利用该引物，对待售样品进行快速检测，实现室内快速检测的应用。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　‘贝栗7号’亲本由安徽江淮园艺种业股份有限公司亲本资源库提供，F1代商品种由本公司质保部提供，分为2份，一份交实验室进行室内检测，另一份安排大田定植鉴定。本试验于2018年10月在安徽省长丰县吴山镇江淮园艺品种示范基地内完成。 　　1.2 SSR引物信息
　　SSR引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物[12]信息见表1。
　　1.3 DNA提取
　　热碱法：随机选取F1代商品种子约250粒，浸种催芽，待芽长至1 cm左右时，将芽置于96孔板中，共2板。每孔分别加入0.2 mol·L-1 NaOH溶液100 μL，98 ℃ 1 h。结束后每孔加入1.0 mol·L-1 pH 6.0 Tris-HCl溶液10 μL，涡旋震荡，上清液即为DNA模板。
　　CTAB法[18]：提取亲本材料叶片的DNA，-20 ℃保存备用。
　　1.4 PCR扩增
　　试验过程中用到的Taq酶、dNTPs、DNA Marker购自康为世纪生物科技有限公司。PCR反应体系为20 μL：ddH2O 13.5 μL，10×PCR 缓冲液（含Mg2+）2 μL，dNTPs 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq 酶0.1 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min， 94 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32个循环，72 ℃延伸 3 min，25 ℃保存。
　　1.5 电泳拍照
　　采用琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为3%（w，下同），电压220 V，电流100 A，电泳50 min，电泳结束后置于凝胶成像系统中拍照分析，判断待检南瓜杂交种子是否具有父本种子、母本种子或者杂交种子的条带特征，计算待测南瓜杂交种子的纯度，纯度/%=（已检测F1代样品总数-非杂交种条带个数）/已检测F1代样品总数×100。
　　2 结果与分析
　　2.1 亲本材料引物筛选
　　利用24对南瓜SSR核心引物筛选‘贝栗7号’品种的亲本与F1代，结果如图1所示，共筛选出4对有大小差异的引物。
　　从图1可以看出，在这24对引物中，共有9、12、15和18号4对引物，扩增出的父本、母本、F1代条带区分明显，可作为杂交种纯度鉴定候选引物。其中12和15这两个引物擴增出的F1代有大小相近3个条带，18号引物扩增出的F1代有一条大小偏大的非特异性条带，作为备选引物。9号引物扩增出的条带清晰，故选择该引物用于杂交种纯度鉴定。
　　2.2 F1代商品种的室内纯度鉴定
　　从发芽的种子中随机选取192个样本进行纯度鉴定，分为A、B两板，各96个样，选用9号引物进行分子标记纯度鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳，统计试验结果（图2～3）。
　　从图2～3中可以看出，A板中38号和B板中的41、55、56号，这4个样本所扩增出的条带与F1代不同，与母本相同，判定为非杂交种;其他188个样与F1代扩增出的条带相同，判定为杂交种，纯度鉴定结果为97.92%。
　　2.3 F1代商品种的田间纯度鉴定
　　田间定植于2018年8月中旬完成，共146株，于10月中旬鉴定，结果显示，146株植株中有3株杂株，纯度为97.95%。
　　3 讨论与结论
　　选用9号引物进行亲本引物筛选时，F1代杂交种上清晰地看到2条带，但批量鉴定时，杂交种出现了3条带，猜测与电泳时间增长、延迟拍照有关。同时，父本电泳时间增长，也会出现与母本条带大小不同的2条带，但不影响鉴定结果的判断。
　　本试验同时也开展了18号引物，对同一批‘贝栗7号’样本的检测，在相同的模板位置处也检测出不同于杂交种的条带，与母本条带大小相同，但有的杂交株未扩增出条带，计算纯度结果发现，与9号引物鉴定的纯度97.92%相比略有下降，只有97.70%，在合理误差范围内，不影响鉴定结果。导致鉴定株数减少的原因可能是碱法提取的DNA不易保存，常温下容易降解，以及2个引物鉴定时间不一致造成的。
　　在筛选的4个差异引物中，在扩增F1代时，均出现了非特异性条带，推测是提取DNA的方法不同导致的，CTAB法提取的亲本DNA纯度高，扩增效果好，而热碱法提取的F1代DNA纯度不高，杂质多，容易扩增出非特异性条带。
　　在本试验中，利用SSR分子技术，选取的9号和18号引物均可在室内快速鉴定‘贝栗7号’南瓜种子的杂种纯度，与田间种植鉴定相比，大大缩短了鉴定所需时间，减少人力物力等成本。在同一批次样本中，室内鉴定与田间鉴定的结果符合率高达99.97%。因此，在实际应用中，利用SSR快速鉴定技术，在3～5 d便可检测出种子纯度，极大有利于种子的生产销售，具有极其重要的应用价值。
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