矮化核桃枝枯病病原菌的形态与分子鉴定

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　　摘要 为了明确河南省洛阳地区核桃枝条一种新病害的病原种类，对采自田间的典型症状枝条进行了常规组织分离，对单孢菌株进行了形态鉴定、rDNA ITS序列分析及致病性测定。结果表明，病原菌在PDA培养基上菌落初为白色，随着色素的积累，由中心向边缘变为灰绿色，再变成墨绿色，最终全部变成黑色;气生菌丝棉絮毛状，菌落边缘不整齐，近圆形或不规则形。分生孢子器散生或聚生，呈黑色小粒状，分生孢子器球形或近球形，深褐色，具孔口;分生孢子梗短缺，无色，杆状，末端产生分生孢子;分生孢子梭形、纺锤形，无色，无隔，基部钝圆，顶部稍尖，单孢（24.5～29.0）μm×（4.8～7.5）μm。离体枝条接种结果表明，该菌能侵染核桃枝条引起与田间相同的症状。据此将分离物鉴定为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。
　　关键词 核桃; 枝枯病; 葡萄座腔菌; 形态鉴定; 分子鉴定
　　中图分类号： S 436.64
　　文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018252
　　Abstract In order to clarify the pathogen of a new disease of walnut branch in Luoyang， Henan province， routine tissue separation of typical symptomatic branches from the field was carried out， and the morphological identification， rDNAITS sequence analysis and pathogenicity determination were performed for single spore strains. The results showed that the colony of the pathogen was initially white in the PDA medium， and with the accumulation of pigment， it was graygreen from the center to the edge; then it turned atrovirens， and eventually it turned black; the aerial hyphae were floccular and hairy， with irregular colony edge and nearly round or irregular shape. Pycnidia were scattered or aggregated， with small black granules， spherical or nearly spherical， dark brown， with orifice; conidiophores were short， colorless， rodshaped， and at the termina were conidia; conidium was fusiform， colorless， without septum， with obtuserounded base， slightly pointed apex， and single spores （24.5-29.0）μm×（4.8-7.5）μm. The results of inoculation in excised branches showed that the pathogen could infect the walnut branches and cause the same symptoms as those in the field. Accordingly， the isolate was identified as Botryosphaeria dothidea.
　　Key words walnut; branch blight; Botryosphaeria dothidea; morphological identification; molecular identification
　　核桃仁因含有多種人体必需的微量元素、矿物质及一些维生素，具有较高的营养价值，是世界著名的“四大干果”之一[1]，深受消费者喜爱。近年来，种植核桃市场前景广阔，经济效益显著，栽培面积迅速扩大;但由于苗木引进把关不严、栽培管理方式粗放等原因，病虫危害日益加重[2]。已报道核桃真菌性病害有核桃白粉病[3]、核桃溃疡病[4]、核桃枝枯病、核桃腐烂病[5]、核桃叶斑病[6]等，有多种病原真菌可以侵染核桃引起枝枯病，包括胡桃楸拟茎点霉Phomopsis juglandina，葡萄座腔菌属的Botryosphaeria dothidea、B. fabicercianum、B.obtusa，半知菌亚门黑盘孢Melanconium juglandinum[7]以及新壳梭孢Neofusicoccumparvum[8]，越橘间座壳Diaporthe vaccinii[9]等。
　　传统的真菌形态学鉴定为其分类提供了基本的依据，但是有一些真菌例如Botryosphaeria类真菌，仅依靠形态学特征并不能准确做出关于其发育的系统分类，而rDNA的ITS序列分析则可以弥补单独依靠形态学特征所不能完成的真菌种、属的鉴定[10]。
　　调查发现，在河南省洛阳市农丰科技有限公司核桃园所种植的矮化核桃品种，病害发生严重，影响了该公司核桃的产量、质量。为了查明病因，减少核桃种植的损失，课题组采集具典型症状的核桃枝枯病病样，对病原菌进行分离培养、纯化与鉴定，以进一步确定病原菌的种类，为枝枯病的防治提供理论依据。 　　1 材料与方法
　　1.1 病原菌的分离、纯化与培养
　　2017年3月至2018年3月，从河南省洛阳市农丰科技有限公司核桃园采集具有典型病害症状的枝条，带回实验室进行流水清洗，依次编号并拍照。带有病原菌子实体病症的枝条，直接挑取子实体于PDA培养基上培养;无病原菌子实体病症的枝条进行常规的病菌组织分离[11]。将分离纯化获得的菌株转至PDA斜面试管保存。
　　1.2 致病性测定
　　挑选健康、幼嫩的矮化核桃枝条，无菌水冲洗，70%乙醇表面消毒;用灭菌针在枝条上针刺形成轻微伤口;用灭菌的打孔器将在PDA培养基上活化3 d的供试菌株菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼，将菌饼有菌丝的一面粘贴于枝条的伤口处;将接种后的枝条置于保湿器内，25℃条件下光照培养，观察记录发病情况。以无菌的PDA菌饼为对照，重复3次[12]，每一重复5个枝条。
　　1.3 病原菌的形态学观察
　　将分离纯化的菌株接种于PDA培养基，置于25℃恒温培养箱中培养，5 d后测量菌落的直径，观察菌落颜色、表面的纹饰、形态与质地，描述其培养特征。
　　从田间采回的发病枝条，选取具子实体的典型样本，制临时水玻片，在光学显微镜（带测微尺）下观察其形态特征，并测量分生孢子、分生孢子器、子囊座、子囊及子囊孢子的大小;选取具子实体的发病枝条，进行石蜡切片[12]，在显微镜下进一步观察病原菌的形态特征。
　　1.4 rDNAITS序列分析
　　在PDA上培养5～7 d后的菌落，用改良的CTAB法[13]提取菌株DNA;利用通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）将提取出来的DNA进行PCR扩增。设计25 μL PCR反应体系：10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、10 μmol/L ITS1 1 μL、10 μmol/L ITS4 1 μL、5 U/μL rTaq酶 0.25 μL、模板DNA 1.0 μL，用ddH2O將反应体系补至25 μL。反应条件为：94℃预变性5 min;94℃变性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸105 s，共30个循环;最后72℃延伸10 min。反应结束后，4℃保存，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，经GelRed染色，在紫外灯下检测扩增产物的有效性。检测到合适条带后，将其所对应的原始扩增产物（未纯化）送交上海生物工程有限公司进行序列测定。
　　获得序列用CLUSTAL软件比对拼接后，在GenBank数据库中用 BLAST进行ITS序列比对，将目标序列及其同源性高的序列编辑后，通过MEGA 软件用邻接法（neighbourjoining）构建进化树。
　　2 结果与分析
　　2.1 分离物的致病性
　　在核桃园，枝枯病一般发生在树干的侧枝或新生枝的末端，发生病变的枝干表层呈现暗灰褐色、或者浅红褐色、或深灰色，呈干枯状（图1a）。发生病害部位与其他地方相比稍微凹陷，并与健康部位交界处形成“V”形或椭圆形病斑，颜色深褐色（图1b）;在发病后期，出现典型的病征：病枝皮层下会形成许多近圆形瘤状突起的小黑点，直径大约0.4 mm，埋生或半埋生，群生且较密，为病原菌的分生孢子器或子囊座（图1c、d）。有的核桃树主枝上也有，说明发病后病菌会从侧枝逐渐蔓延到主枝;患病枝条的叶片黄化、枯萎、卷曲，甚至脱落。
　　人工接种第2～3天后，在幼嫩枝条上接有菌饼的地方出现椭圆形或“V”形病斑，病斑处颜色为褐色，中部颜色较浅，水渍状，且略微有凹陷，大小约为1.6 cm×0.7 cm（图2a、b）。接种第5天，对照组不发病（图2c），而接种核桃枝条在原接种处有白色棉絮状菌丝产生，并且褐色病斑已扩展至整根枝条的2/3左右，侵染严重的地方颜色变为深灰色近乎黑色（图2d）。接种15 d，整根枝条变为黑色，且在枝条上出现黑色小点（图2e）。从接种发病的核桃枝条上挑取菌丝、小黑点，以及从病健交界处获取发病组织，再次进行分离、纯化，重新获得了病原菌，且菌落形态和分生孢子形态上与接种所用的病原菌完全一致，证实该菌对矮化核桃枝条具有致病性，并产生枝枯症状。
　　2.2 形态学特征
　　在田间发病的枝条上，分生孢子器和子囊座自皮层下顶出，呈黑色瘤状突起，群生。分生孢子器黑色，球形或近球形。光学显微镜下观察，分生孢子器球形或近球形，颜色深褐色或黑色，具孔口（104.3～115.2）μm×（118.5～123.2）μm（平均110.0 μm×120.0 μm）（图3a）;分生孢子梭形、纺锤形，无色，单孢（25.0～31.2）μm×（5.8～8.0）μm（平均27.1 μm×7.3 μm）（图3b）。子囊座黑色，具孔口（220.0～228.0）μm×（260.0～276.0）μm（平均224.0 μm×275.0 μm）（图3c）;子囊长棍棒形，具短柄，双层壁，成熟时易消解（19.8～22.3）μm×（147.5～158.2）μm（平均20.7 μm×150.0 μm），内含8个子囊孢子（图3d）;子囊孢子双列，椭圆形，单孢，无色，内有油滴状物（17.8～26.3）μm×（8.4～12.5）μm（平均24.6 μm×11.2 μm）（图3d）。
　　在PDA培养基上，菌丝3～4 d即可布满全皿（90 mm），菌落初为白色（图4a1、a2），渐变为灰色、黑色，气生菌丝棉絮毛状，在培养皿中部往往形成菌丝束直达皿盖（图4c1、c2）;菌落边缘不整齐，近圆形或不规则形，培养3～4 d后出现色素，随着色素的积累，由中心向边缘初为灰绿色，再变成墨绿色，最终全部变成黑色。菌落日生长速率约为17.1 mm/d。6～7 d左右，部分菌丝纠结在皿底形成分生孢子器，散生或聚生，呈黑色小粒状，内有大量分生孢子（图4b1、b2）。光学显微镜下观察，菌丝透明无色或褐色，有隔，直径约为4.8 μm。分生孢子器球形或近球形，深褐色，具孔口（图3e）;分生孢子梗短缺，无色，杆状，末端产生分生孢子（图3f）;分生孢子梭形、纺锤形，无色，无隔，基部钝圆，顶部稍尖，单孢（24.5～29.0）μm×（4.8～7.5）μm（平均26.2 μm×5.4 μm）（图3f）。在PDA上培养的菌株未发现子囊座、子囊以及子囊孢子。根据形态学观察，初步鉴定分离菌株为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。 　　2.3 rDNAITS序列分析
　　对分离物的PCR产物双向测序后，其有效序列长度577 bp。将分离物测序获得的序列上传至GenBank数据库，获得其ITS序列登录号为：MH329650。在GenBank中进行Blast比对，结果表明，该序列与KU686880.1等的B.dothidea（葡萄座腔菌）序列同源性大于99%。结合形态学鉴定结果，将分离的核桃枝枯病病原菌鉴定为葡萄座腔菌B.dothidea，其分类地位为真菌界，子囊菌门，腔菌纲，格孢腔菌目，葡萄座腔菌科，葡萄座腔菌属（图5）。
　　3 结论与讨论
　　依据分离物的形态学观察、ITS序列分析及致病性测定，将引起洛阳地区矮化核桃枝枯病的病原菌鉴定为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea，其分类地位为真菌界，子囊菌门，腔菌纲，格孢腔菌目，葡萄座腔菌科，葡萄座腔菌属。该病原菌与赵丹等[12]报道的引起洛阳牡丹溃疡病的葡萄座腔菌以及徐成楠等[14]报道的引起辽宁地区越橘枝枯病的葡萄座腔菌相一致。
　　葡萄座腔菌存在有性型和无性型阶段，关于无性型的报道比较多，包括Dothiorella、Diplodia、Lasiodiplodia、Fusicoccum和Sphaeropsis等属[15]。其主要分类特征为子座、子囊、子囊孢子以及分生孢子的形状、纹饰、颜色、分隔、长宽比、大小及壁厚度等[16]。但是，由于在自然界和实验室人工条件下培养的葡萄座腔菌Botryosphaeriaceae通常以无性型较常见，有性型少见，长期以来对于该属真菌的分类学鉴定主要基于无性型的形态特征。另外，培养菌落颜色、气生菌丝生长情况及子囊孢子表面超微结构（纹饰）也可用于葡萄座腔菌科真菌的分类和鉴定。随着分子生物学的快速发展，rDNAITS序列分析作为一种快速准确的手段被广泛用于植物病原真菌的分类鉴定[17]。核糖体DNA转录间隔区（rDNAITS）序列是真核生物rDNA的内含子序列，因其在进化上具有显著的种属特异性，已被广泛应用于很多真菌目、科、属、种等的分类鉴定及系统发育分析。位于5.8S和18S之间的ITS1，在种及种以下水平的研究中非常有价值。位于5.8S和28S之间的ITS2，有关研究证明其在更高级生物分类学水平上包含有价值的生物学信息。因此ITS序列可用于了解基因组同源性、物种系统发育史、基因渗透和其他进化问题[18]。
　　葡萄座腔菌是一类世界性分布的真菌，在国外引起蓝莓枝枯病[19]、苹果轮纹病[20]、葡萄溃疡病[21]等病害。在国内主要分布于华北、东北、江淮等地区，侵染多种木本植物引起溃疡病或干腐病，是重要的生物灾害之一[22]。该菌在河南洛阳侵染核桃引起大片干枯死亡，造成严重的经济损失，建议生产中应冬季清除病原，早春提前预防，降低病害的危害程度。
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　　（责任编辑：田 喆）
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