武陵山区稻瘟病菌生理小种分子鉴定体系的建立

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　　摘要 [目的]建立武陵山区稻瘟病菌生理小种分子鉴定体系。[方法]选用RAPD、REMAP、Rep-PCR 3种分子标记和无毒基因检测，对武陵山区稻瘟病菌生理小种文库中2013—2015年分离的220个菌株进行指纹图谱的构建和聚类分析。[结果]共统计26对引物扩增得到的3年样本中稳定出现的97条具有多态性的条带。聚类分析结果显示，在 0.75的相似性水平上可将220个菌株分为12个遗传谱系，谱系10为优势谱系，不同年份的稻瘟病菌群体遗传结构存在一定差异，但并未发生明显演化。[结论]建立了新的武陵山区稻瘟病菌生理小种分子鉴定体系，为该地区抗稻瘟病菌品种的选育和布局提供参考。
　　关键词 稻瘟病菌；遗传谱系；鉴定体系；武陵山区
　　中图分类号 S435.111.4+1 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）09-0144-07
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.043
　　Abstract [Objective]To establish molecular identification system of Magnaporthe oryzae in the Wuling Mountain Area of China.[Method]Marker system including RAPD，REMAP，RepPCR and Avr genes was developed for fingerprint mapping and cluster analysis of 220 M.oryzae isolates collected from the Wuling Mountain Area during 2013-2015.[Result]A total of 97 polymorphic bands amplified by 26 pairs of primers were counted.The cluster analysis data showed that 220 strains could be divided into 12 genetic lineages at the 75% similarity level，and the lineage 10 was the dominant lineage.There were some differences in the genetic structure of M.oryzae populations in different years，but no significant evolution occurred.[Conclusion]The study established a new molecular identification system for M.oryzae in the Wuling Mountain Area， and provided a reference for the breeding and distribution of the M.oryzae resistant varieties in this area.
　　Key words Magnaporthe oryzae；Genetic lineage；Identification system；Wuling Mountain Area
　　稻瘟病是水稻重要的病害之一，可引起水稻大幅减产，严重时可减产 40% ～ 50%[1]。在防治稻瘟病的几种手段中，培育抗病品种仍是最经济有效的方法[2]。然而，稻瘟病菌具有复杂的种群结构且变异频繁，可以在抗病品种田间应用的短短几年内克服其抗性[3]。因此，分析稻瘟病菌的遗传结构和变异规律可为预测病害的发生及指导抗病品种的分布提供重要依据，可有效预防宿主抗性丧失引起的疾病流行[4]。随着现代分子生物学技术的快速发展，分子标记技术已被大量运用到稻瘟病菌的群体遗传结构研究中，且取得了巨大进展[5]。最常用的分子标记包括扩增片段长度多态性（AFLP）、限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、反转录转座子 - 微卫星扩增多态性（REMAP）、Rep-PCR技术、特异性扩增片段（SCAR）、简单重复序列（SSR）等[6]，其中RAPD、REMAP、Rep-PCR操作简单，成本低廉，仅需少量DNA和无需放射性等优点。此外，Huang等[7]、Imam等[8]、Selisand等[9]还开发了基于Avr基因的鉴定手段以确定稻瘟病种群的毒力谱。
　　武陵山区是稻瘟病重灾区，水稻种植面积超过70万hm2，最严重时武平县稻瘟病病田率达100%[10]。该地区地形比较复杂，山峦呈高低起伏分布，各地方相對海拔差距较大。水稻作为该地区的主要农作物，稻田主要分布在一些峡谷和沟渠中[11]。由于该地区全年雨量充沛，雾露多，湿气重，水稻生长期的温度和湿度均很高，非常适合稻瘟病菌的繁殖，导致武陵山区稻瘟病菌的生理种类丰富，种群结构复杂，侵略性强。作为国家防治稻瘟病的重点区域，鄂西南地区是研究稻瘟病的理想地区。
　　在前期研究中，武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室从武陵山区采集了感染稻瘟病的水稻稻秆，构建了生理小种文库[12]，并对2012—2014年分离得到的稻瘟病菌生理小种进行了致病性分析[13]与遗传多样性分析[4]。笔者在沿用李泌等[12]的分子标记鉴定体系的基础上，使用RAPD、REMAP、Rep-PCR及无毒基因4种鉴定手段，共26对引物，对2013—2015年分离的稻瘟病菌进行指纹图谱的构建，统计了指纹图谱中具有多态性的主带并建立新的分子鉴定体系，旨在为后续的分子鉴定提供便利，并为该地区抗稻瘟病菌品种的选育和布局提供参考。 　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 菌株。所用稻瘟病菌生理小种均由武汉中南民族大学武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室/生物技术国家民委重点实验室提供。
　　1.1.2 培养基。
　　燕麦片培养基：取无糖燕麦片30 g置于锅内，然后加入清水1 000 mL，煮沸约5 min，过滤网过滤燕麦残渣。过滤液内加入蔗糖15 g，琼脂7 g，121 ℃灭菌20 min。
　　液体培养基：10 g葡萄糖，3 g酵母提取物，加水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌 20 min。
　　1.2 方法
　　1.2.1 菌丝获取。
　　从保存菌种的滤纸条[14]上剪下一小片置于燕麦培养基中心，26 ℃培养7 d左右。用接种针挑取菌块（1 mm×1 mm）于液体培养基中，26 ℃、150 r/min摇床培养3～4 d。镊子夹取菌丝体至2 mL EP管，离心去上清后用真空冷冻干燥机干燥菌丝，捣碎备用。
　　1.2.2 DNA提取。用10% SDS和2% CTAB对约50 mg菌丝粉末进行基因组DNA的提取[15]，将提取的基因组DNA直接电泳（0.8% 琼脂糖凝胶）检测质量及浓度，条带清晰的DNA用于后续PCR的扩增。
　　1.2.3 PCR扩增。
　　选取RAPD、REMAP、rep-pot2-PCR 3种分子标记以及无毒基因对稻瘟病菌基因组DNA进行PCR扩增。扩增体系见表1～4，引物见表5。扩增RAPD扩增程序：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，35 ℃，40 s，72 ℃，2 min，40个循环；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。
　　REMAP扩增程序（Tm统一代表不同引物的退火温度）：92 ℃，5 min；92 ℃，45 s，Tm，45 s，72 ℃，1 min，40个循环；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。
　　Rep-PCR扩增程序：95 ℃，2.5 min；94 ℃，1 min，62 ℃，1 min，65 ℃，10 min，4个循环；94 ℃，30 s；62 ℃，1 min，65 ℃，10 min，26个循环；65 ℃，15 min；4 ℃，保存。
　　无毒基因扩增程序（Tm统一代表不同引物的退火温度）：94 ℃，5 min；94 ℃，45 s，Tm，45 s，72 ℃，90 s，35个循环；72 ℃，10 min；4 ℃，保存。
　　RAPD及REMAP PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，Rep-PCR和无毒基因PCR产物分别用0.8%和1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，上样量为5 μL。
　　2 结果与分析
　　2.1 RAPD电泳检测结果 使用16 对 RAPD 引物对 2013—2015 年分离的 220 个稻瘟病菌基因组进行PCR扩增（2013年部分结果见图1），结果所有条带均大于 500 bp，对照无条带产生。对3年样本的扩增条带进行比较，选择明显、稳定、清晰的条带，统计了 73 个条带。
　　2.2 REMAP电泳检测结果 使用LTR1+ISSR1/4/6这3对REMAP引物进行PCR扩增（2013年扩增结果见图2），由图2可知，大部分条带分布于100～2 000 bp，少量条带大于2 000 bp，对照无条带。对比2013—2015年样本扩增结果，得到了11 个稳定且有多态性的带型。
　　2.3 Rep-PCR电泳检测结果
　　用pot2-1+pot2-2对2013—2015年分离的稻瘟病菌进行PCR扩增（2013年菌株扩增结果见图3），由图3可知，大部分条带分布于1 000～10 000 bp，获得5个稳定带型。
　　2.4 无毒基因扩增电泳检测结果
　　对220个稻瘟病菌进行了包括Avr-pita、Avr-pizt、Avr-ACE1、Avr1-CO39、Avr-pit、Avr-pia的6个无毒基因的检测（2013年扩增结果见图4）。由图4可知，2013年分离的稻瘟病菌都有无毒基因Avr-pizt，在是否含有无毒基因Avr-pia、Avr-pita、Avr1-CO39上具有一定差异，但总体上差异不显著。
　　2.5 鑒定体系建立
　　根据220个稻瘟病菌生理小种的PCR扩增结果，由于RAPD具有重复性差的缺点，从分子标记RAPD扩增得到的超过118条带型中选择73条稳定出现、条带清晰、且3年间稳定存在的带型，加上REMAP和Rep-PCR中分别得到的11和5条带型以及对6对无毒基因的检测，共得到97条能有效区分不同生理小种的条带，将其命名为武陵山区稻瘟病菌生理小种分子鉴定体系（图5）。
　　2.6 聚类分析
　　根据鉴定体系中对应条带扩增的有无，有赋值为“1”，无则赋值为“0”，构建了“0-1”数据库，应用PAST v 3.16对数据进行处理，使用未加权对组平均（UPGMA）算法和Dice相似性指数评估各菌株之间的相似性。聚类结果显示，在相似性系数为0.75时，220个菌株被分为12个遗传谱系，其中谱系1、2、4、5、7、12为2015年的单个菌株，谱系3谱系和8包含2个2015的菌株、谱系6和谱系9分别包含4个和9个2015年的菌株。谱系10为优势谱系，包括33个2013年菌株，26个2014年菌株和137个2015年菌株（图6）。
　　3 讨论
　　在SSR、REMAP、RAPD和AFLP等分子标记中的运用中，通常仅应用1种或2种类型的标记用于分析，得到的信息较少，特别是当群体数目庞大时不能有效地将其分离。该研究将4种鉴定手段（RAPD、REMAP、Rep-PCR和Avr基因）组合起来形成一个鉴定系统，用于对该研究中使用的220个菌株进行分离，且这4种标记的检测仅需要通过常规的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳即可完成。因此，该研究建立了一种简单、低成本、有效的稻瘟病菌遗传多样性分析鉴定系统。基于此鉴定系统，该研究将220个菌株分成12个遗传谱系。结果显示，谱系10为优势谱系，包含97%的2013年菌株、100%的2014年菌株和84%的2015年菌株。表明3年间，武陵山区稻瘟病菌的遗传结构并无显著变化，但随着时间的推移，菌群的遗传背景发生了一定程度的演化，与杨小林等[16]的研究结果一致。进一步证明了该研究所建立的武陵山区稻瘟病菌生理小种的分子鉴定体系的有效性，可为后续武陵山区稻瘟病菌群体演化研究及抗病品种的选育提供极大的便利。 　　参考文献
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