利用多重PCR鉴定西瓜杂交种纯度

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　　摘 要： 为快速、高效鉴定西瓜杂交种纯度，建立一套完善的SSR分子标记鉴定体系，利用覆盖西瓜全基因组的192对SSR标记对小果型西瓜品种‘锦霞八号’亲本进行多态性筛选，共获得36个条带清晰、多态性好的SSR标记，多态性率为18.8%，这些标记分别位于西瓜第1、2、3、4、5、6、8、10、11号染色体。根据这些多态性标记的扩增片段大小，从中选出4对进行双重PCR和三重PCR分组扩增，成功建立了‘锦霞八号’杂交种的双重和三重PCR纯度鉴定体系。3组标记鉴定结果基本吻合，‘锦霞八号’杂交种的纯度为100%。将标记鉴定结果与田间形态学鉴定结果对比，2种方法鉴定的结果高度一致。將三重PCR技术用于鉴定西瓜杂交种纯度，为西瓜杂交种纯度快速高效鉴定奠定了研究基础。
　　关键词： 西瓜; 分子标记; 多重PCR; 纯度鉴定
　　中图分类号：S651   文献标志码：A   文章编号：1673-2871（2020）02-017-05
　　Identification of purity of watermelon hybrids by multiplex PCR
　　YANG Huihui1， LI Hewei1， ZHAO Yongwei2， YUAN Shengkai1，2， YANG Luming1， HU Jianbin1， SUN Shouru1， MA Changsheng1，2， ZHU Huayu1
　　（1. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. Henan Yuyi Seed Industry Technology Development Co.， Ltd.， Zhengzhou 450002， Henan， China）
　　Abstract： In order to quickly and efficiently identify the purity of watermelon hybrids， a complete SSR molecular marker identification system was established. In this study， 192 pairs of SSR markers covering the whole genome of watermelon were used to screen polymorphisms of the small fruit watermelon variety ‘Jinxia No. 8’， and 36 bands with clear and polymorphic SSR markers were obtained，the polymorphism rate was 18.8%， and these markers were located on chromosomes 1， 2， 3， 4， 5， 6， 8， 10， and 11， respectively. Based on the amplified fragment size of these polymorphic markers， 4 pairs were selected for double PCR and triple PCR group amplification， and the double and triple PCR purity identification systems of ‘Jinxia No. 8’ hybrids were successfully established.The results of the three pairs of markers were basically consistent， and the purity of the ‘Jinxia No.8’ hybrid was 100%. The results of marker identification were highly consistent with those of field morphological identification.For the first time， the triple PCR technique was used to identify the purity of watermelon hybrids， which laid a solid foundation for the efficient and rapid identification of watermelon hybrids.
　　Key words： Watermelon; Moleculer marker; Multiplex PCR; Purity identification
　　西瓜（Citrullus lanatus）为葫芦科西瓜属一年蔓生草本植物，是世界上重要的园艺作物之一。中国是西瓜最大的生产和消费国，西瓜栽培历史悠久。在育种过程中，因品种鉴定所需周期较长，费用较高，且鉴定的结果具有不确定性，所以种子的纯度鉴定是一项难题，而种子的质量直接影响农产品的品质及农民的收益，因此，对杂交种进行纯度鉴定以保证种子质量及生产效益是极其必要的[1]。常用的种子纯度鉴定方法有形态学鉴定和分子鉴定。传统的形态学鉴定易受环境、气候和人为因素的影响，且存在费时费地费力等缺点[2]。利用分子标记技术能够从DNA水平上检测杂交种和亲本之间的差异，克服了空间的限制，极大缩短了检验所需时间[3]。目前常见的分子标记有RAPD标记、SRAP标记、EST-SSR标记等，但是利用这些标记进行纯度鉴定具有局限性，而SSR标记具有数量丰富、共显性遗传、重复性好、操作简便等优点，适于进行杂交种纯度的鉴定[4-5]，如孙波等[6]利用SSR分子标记技术对西瓜品种‘雪龙三号’进行种子纯度鉴定，鉴定结果验证了西瓜品种的真实性。但是研究者多数是利用单一PCR扩增鉴定品种真实性，此做法虽然可以区分出亲本自交株，但是对于品种间的机械混杂则难以区分。 　　多重PCR（multiplex PCR，M-PCR）又称复合PCR，是指在一个PCR反应体系中加入2对或多对引物，能同时扩增出多个核酸片段，其反应原理、反应试剂和操作过程与单一PCR相同。与单一PCR相比，多重PCR利用选取位于不同染色体的标记进行组合，不仅可以检测出亲本自交种，同样可以鉴定出掺杂其中的其他品种。另外，多重PCR也可以节约一定的时间和试剂用量。刘子记等[1]利用两重PCR对西瓜品种进行纯度鉴定，证明了双重PCR可以有效提高检测效率的可行性;吴明生等[7]利用三重引物进行扩增，促进了SSR技术在玉米种子纯度中的应用;陈浩东等[8]最多利用4重PCR對杂交棉进行纯度鉴定，奠定了棉花杂交种快速鉴定的基础;胡倩梅等[9]利用多重PCR鉴定甜瓜种子，建议添加2对或3对标记进行多重PCR。目前，多重PCR应用在西瓜品种纯度鉴定的研究报道较少。
　　笔者以小果型西瓜品种‘锦霞八号’为研究对象，选取部分多态性引物，建立不同的引物组合，将三重PCR技术应用于西瓜杂交种的纯度检测，以期实现对西瓜品种快速而准确的纯度鉴定。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　供试西瓜品种‘锦霞八号’及其父母本由河南豫艺种业科技发展有限公司提供。
　　1.2 方法
　　1.2.1 DNA的提取 将‘锦霞八号’种子200粒，亲本各5粒，采用温汤浸种，将种子用55～60 ℃热水浸泡10～15 min后，用KMnO4 5 000倍液常温浸泡6～8 h。浸种后于恒温培养箱中32 ℃左右催芽。分别放置育苗盘育苗。待幼苗子叶展平后进行采样。
　　为保证DNA的质量以及扩增产物条带的清晰度，利用改良CTAB法提取亲本和杂交种的DNA。用微量核酸蛋白分析仪检测DNA浓度及质量。
　　1.2.2 SSR引物多态性分析 在Zhu等[10]从西瓜全基因组开发的SSR引物中选出覆盖西瓜全基因组的192对引物进行引物筛选和多态性分析。以‘锦霞八号’亲本为材料进行引物筛选，筛选出引物产物片段大小不同的标记，便于进行多重PCR扩增。
　　1.2.3 PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 单一PCR反应体系及程序：PCR反应体系共10 ?L：模板1 ?L，引物1 ?L，Master Mix 5 ?L，ddH2O 3 ?L。PCR反应程序：预变性95 ℃ 5 min，变性94 ℃ 45 s，退火58～68 ℃ 1 min，8个循环，72 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，20个循环，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。
　　多重PCR反应体系及程序：在单一PCR 10 ?L反应体系中加入2对或3对标记，调整ddH2O体积，其余成分与单一PCR扩增体系相同。反应程序与单一PCR相同。
　　PCR产物用6%（w）聚丙烯酰胺凝胶电泳90 min，使用银染法染色[11]，观察分析电泳结果。
　　1.2.4 比较SSR分子标记的纯度鉴定结果与大田纯度鉴定结果 根据PCR产物的电泳带型，统计杂交种和非杂交种带型的数量，计算杂交种纯度。SSR鉴定品种纯度/%=[（杂交种带型的数量/总检测数）]×100[12]。
　　田间纯度鉴定结果由科研人员通过观察株型、叶片、果形、果皮颜色等形态指标进行鉴定。最后将SSR纯度鉴定结果与田间种植的鉴定结果进行比较分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 SSR引物筛选结果
　　将覆盖西瓜全基因组的192对引物在‘锦霞八号’亲本间进行多态性筛选，其中有36对引物在‘锦霞八号’亲本及F1之间具有多态性，多态性比率为18.8%（表1），分别位于西瓜第1、2、3、4、5、6、8、10、11号染色体。
　　2.2 SSR标记分组及多重PCR建立
　　根据表1中引物扩增片段的大小和多态性差异，选取位于不同染色体上的4对引物ClSSR03386（232 bp）、ClSSR04334（245 bp）、ClSSR0309843（132 bp）、ClSSR16601（197 bp）进行多重PCR分组及扩增。进行多重PCR组合时，以扩增片段相差至少大于35 bp进行分组，两重PCR组：ClSSR03386和ClSSR09843，ClSSR04334和ClSSR09843;三重PCR组合：ClSSR03386、ClSSR09843、ClSSR16601。
　　2.3 ‘锦霞八号’纯度的鉴定
　　利用两重PCR和三重PCR组合对200份‘锦霞八号’杂交种进行纯度鉴定。首先对两重PCR组合进行扩增（图1～2），电泳条带明显分布在2个区域，第一区域为引物ClSSR03386多态性片段分布区域，第二区域为引物ClSSR09843多态性片段分布区域。由图1可知，引物ClSSR03386和引物ClSSR09843在200个单株中均能扩增出清晰条带，且为父母本杂合带型。
　　由图3可知，同时对三重PCR组合进行扩增，电泳条带明显分布在3个区域，第1区域为引物ClSSR03386多态性片段分布区域，第2区域为引物ClSSR16601多态性片段分布区域，第3区域为引物ClSSR09843多态性片段分布区域。引物ClSSR03386、ClSSR16601和ClSSR09843均能扩增出条带，且为父母本杂合带型。
　　将两重PCR结果与三重PCR结果进行对比分析，结果表明，利用两重PCR和三重PCR对‘锦霞八号’杂交种进行纯度鉴定的结果完全一致，由此得出‘锦霞八号’西瓜品种的纯度为100%。
　　2.4 SSR标记与田间纯度鉴定的比较
　　田间种植中，在果实发育期通过观察株型、叶片、果形、果皮颜色等形态指标，对‘锦霞八号’进行鉴定，其田间纯度为98.8%。多重PCR鉴定结果与田间种植鉴定结果纯度偏差为100%-98.8%=1.2%，符合纯度鉴定中允许的误差范围（2%）。试验结果说明，利用SSR标记可用于鉴定西瓜杂交种纯度，而多重PCR可以快速而准确地鉴定西瓜杂交种纯度，保证品种的真实性。 　　3 讨论与结论
　　 目前市场上销售的西瓜种子均为杂交一代，种子纯度是其质量的重要指标之一[13]。按照国家标准的规定，西瓜杂交品种的纯度必须高于95%[14]。在人工生产种子的过程中，母本去雄不彻底、机械混杂和生物学混杂等原因都会降低种子纯度。综合前人对西瓜品种纯度鉴定的研究，多数研究者利用单一的PCR扩增确定品种的真实性，虽然可以区分出亲本自交种，但对品种间的机械混杂鉴定存在局限性。前人证实了SSR分子标记技术的可行性[15]。孙波等[6]利用23对SSR核心引物对西瓜品种进行纯度鉴定，其结果充分说明了SSR分子标记鉴定品种纯度的可靠性。张佩伦等[16]利用SSR標记对4个西瓜品种进行纯度鉴定，其结果与田间形态学鉴定结果高度一致。利用单一引物进行杂交种纯度鉴定时，多数研究者大多采取热碱法、SDS法等快速提取植物基因组DNA的方法;但是利用多重PCR进行鉴定时多数研究者则是采取CTAB法提取DNA[17-18];常宏等[19]在对玉米种子真实性的鉴定中得出，相比较CTAB法和热减法提取的DNA，CTAB法提取的DNA质量较高，且电泳结果主带较清晰;而热减法提取的DNA质量较差，主带出现严重拖尾。胡倩梅等[9]利用碱裂法提取甜瓜叶片DNA，构建多重PCR体系，发现利用4对引物同时进行扩增时会影响判断条带的准确性，添加2对和3对引物可以准确判断引物扩增出的条带。所以，对于粗提DNA的方法是否可以应用到多重PCR鉴定西瓜纯度，有待于进一步研究。
　　笔者通过对覆盖西瓜全基因组的192对引物进行筛选，36对引物在‘锦霞八号’及其亲本之间具有多态性，多态性比率为18.8%，从中选择4对位于西瓜不同染色体上的SSR标记检测‘锦霞八号’纯度。通过构建双重和三重PCR体系，对‘锦霞八号’杂交种进行纯度鉴定，双重PCR结果和三重PCR结果基本吻合。分子鉴定结果与田间鉴定结果高度一致，与前人研究结论一致。利用SSR分子标记技术对西瓜杂交种进行纯度鉴定，将结果与田间形态学鉴定的结果对比，两者纯度偏差为1.2%，符合允许的误差范围（2%）。
　　笔者利用多对特异性引物建立多重PCR体系进行纯度鉴定，同时验证品种的真实性和种子纯度，过程快速方便、结果准确可靠，本研究结果也对西瓜杂交种利用多重PCR进行纯度鉴定的相关研究提供一定的参考。
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