番茄抗性基因Ty-2和Ph-3多重PCR的检测应用

来源:用户上传      作者:林涛 蔡锦玲 郑凯玲

　　摘要 创建可以同时检测番茄抗黄化曲叶病毒病Ty-2基因和抗晚疫病Ph-3基因分子标记的多重PCR体系，以快速准确地鉴定筛选到目标基因型。采用多重PCR结合CAPS技术，同时加入2对引物T0302和TG328，进行扩增及酶切反应，2%琼脂糖凝胶电泳检测，获得不同基因型相应的带型，从而建立多重PCR及产物酶切体系，优化此体系后再进行验证与应用。该多重PCR体系可靠高效，显示共有9种带型对应Ty-2和Ph-3基因相应的基因型，与采用单引物普通PCR技术分别鉴定的基因型结果一致，可以用于番茄分子标记辅助育种。
　　关键词 番茄;多重PCR;CAPS;分子标记
　　中图分类号 S641.2 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）03-0101-04
　　Abstract We established a multiplex PCR system to identify Ty2 and Ph3 resistance genes of tomato simultaneously，for rapid and accurate identification and screening of target genotype.Multiplex PCRCAPS technology was used to amplify and react with two pairs of primers T0302 and TG328.2%agarosegel electrophoresis was used to detect the corresponding bands to differentiate the genotype of the identified materials，and to establish multiplex PCR system.The results showed that there were 9 kinds of bands corresponding to the genotypes，which were consistent with the genotype identified by single primer PCR.The multiplexPCR systems are reliable and efficient，it could be very useful for markerassisted selection during early stage in tomato and speed up breeding procedure.
　　Key words Tomato;Multiple PCR;CAPS;Molecular marker
　　近年来，番茄黄化曲叶病毒病在我国广西到山东沿海省份，以及云南、山西、新疆、河南、安徽、河北等番茄主产区均有暴发[1]。番茄晚疫病是致病疫霉菌侵染所致，一旦暴发常导致减产，甚至绝产，是一种番茄的毁灭性病害[2]。番茄黄化曲叶病毒病和晚疫病已成为高温多湿番茄产区抗病育种的主攻方向之一。抗病性的鉴定受到发病条件、植株生理状况、评价标准等影响，提高选择效率是创制和筛选鉴定番茄育种新材料的关键。借助分子标记技术可以对育种材料进行早期、高效的选择，加速品种选育与改良的进程[3]。
　　目前已经在番茄中发现的抗TYLCV 的基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4 和Ty-5，其中抗性基因Ty-1和Ty-3为等位基因[4]。Ty-2 基因是源于多毛番茄的单个显性基因，Garcia等[5]开发了与Ty-2紧密连锁的共显性SCAR 标记T0302。番茄晚疫病抗性受两类不同的基因控制，一类是单基因控制的质量性状，包括完全显性基因Ph-1，不安全显性基因Ph-2和Ph-3，它们均来自醋栗番茄;另一类是多基因控制的数量性状，其抗病性与环境、植株长势等多种因素有关[6]。Ph-3基因是番茄抗晚疫病育种中分子标记辅助选择常用的一个基因[7-10]。孔凡慧[11]的研究表明，标记TG328特异性引物可以很好地区分含番茄晚疫病抗性基因Ph-3的纯合抗性材料、杂合抗病材料和不含Ph-3的感病材料，可以应用于番茄抗晚疫病种质资源的辅助选择。然而在大中果型番茄种质中，抗黄化曲叶病毒病的材料基本上为含Ty-1基因，而含纯合Ty-2或Ph-3抗性基因的材料很少。陈宝玲等[12]研究选用的56份大、中果型番茄材料，含杂合抗性基因Ty-2 的材料仅1 份;含纯合晚疫病抗性基因Ph-3的材料只有1 份，杂合6 份。多重PCR是在一个反应体系中同时扩增多个目的片段，与普通PCR 相比有高效和低成本的优势[13]。国内利用多重PCR 技术对番茄抗性基因进行鉴定已有一定的研究，但能同时鉴定Ty-2和Ph-3基因的多重PCR体系尚未见报道[14-16]。
　　该研究利用共显性分子标记Ty-2基因的SCAR的引物T0302和Ph-3基因的CAPS标记的引物TG328，结合多重PCR和CAPS技术的优点，从已知基因型的番茄材料中，获得不同基因型相应的带型，建立和优化可以同时检测这2个抗病基因分子标记的多重PCR体系，采用此技术通过酶切产物的带型来区别筛选目标材料的基因型。该研究增加了番茄黄化曲叶病毒病和晚疫病快速分子标记的鉴定手段，可促进抗性基因Ty-2和Ph-3的轉育聚合，尤其在创制大果型番茄育种新材料及复合多抗品种分子标记辅助选育中具有一定的应用价值。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　多重PCR技术建立与优化试验所用番茄材料（编号1～9，A为CK1和B为CK2）来自泉州市农业科学研究所，已经田间病害鉴定过，单引物普通PCR已分别鉴定了Ty-2和Ph-3抗性基因的基因型。由表1可知，材料1～3号感番茄TY2（ty-2/ty-2基因型）;4～6号材料为纯合Ty-2基因型，表现为抗番茄TY2;7～9号为杂合Ty-2基因型;其中2、5和8号含杂合Ph-3抗性基因，3、6和9号含纯合Ph-3基因型，而1、4、7号不含抗性基因Ph-3。CK1基因型为Ty-2/Ty-2和Ph-3/Ph-3，作双抗对照，CK2 则为双感对照。 　　1.2 DNA的提取与引物设计
　　采用改良的CTAB 法[17]，提取试验DNA后贮存在-20 ℃的冰箱中备用。参照Garcia 等[5]开发的共显性SCAR 标记T0302设计Ty-2基因标记的引物序列，Ph-3基因的共显性CAPS标记TG328参照文献[7]的设计，所用标记的引物序列见表2，引物由北京天一辉远生物科技公司合成。
　　1.3 多重PCR 体系的建立与优化
　　采用多重PCR结合CAPS技术，同时加入2对引物进行扩增后，再进行扩增产物CAPS的酶切反应，获得表1中番茄材料已知抗性基因Ty-2和Ph-3基因型组合所对应的带型，然后进一步优化该多重PCR及产物酶切体系。
　　PCR 反应体系20 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye） 10 μL，2对引物的正反引物（10 μmol/μL）各0.4 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 补足至20 μL。
　　1.4 多重PCR体系的验证与应用
　　采用经优化过的多重PCR 体系对泉州市农业科学研究所的24 份番茄材料（编号801～824）进行基因型鉴定应用，即通过多重PCR酶切产物带型区别判断其相应的基因型，再与使用单引物普通PCR扩增的特异性标记片段分别进行分析比对，以验证该多重PCR技术。
　　Ty-2基因单引物扩增的PCR反应体系为20 μL：10×PCR Buffer 2.0 μL（含Mg2+），dNTP（各2.5 mmol/μL）0.4 μL，正反引物（10 μmol/μL）各0.4 μL，DNA 模板1.0 μL，easyTaq 酶（5 U/μL）0.1 μL，ddH2O 补足至20 μL。PCR 扩增程序为94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，35个循环;72 ℃延伸10 min。
　　Ph-3基因单引物扩增PCR反应体系同Ty-2基因，PCR 扩增程序退火温度为58 ℃，72 ℃延伸30 s，其他条件相同;酶切体系25 μL：2.2 μL ddH2O， 10×Buffer 2.5 μL，MvaI （BstNI） 酶（10 U/μL） 0.3 μL，混合后加到20 μL PCR产物中，水浴温度37 ℃条件下，酶切2 h。
　　普通PCR 产物于加有Gold View的1.2%琼脂糖凝胶、110 V 电压下电泳20～30 min 检测，在伯乐凝胶成像分析系统上显示结果。
　　以上PCR SuperMix（+dye）混合液、easyTaq酶、Buffer和dNTP订购自北京全式金生物技术公司，快切酶FastDigest MvaI 和限制性内切酶MvaI （BstNI）酶订购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
　　2 结果与分析
　　2.1 酶切前扩增的特异标记片段
　　分子标记SCAR引物T0302和CAPS引物TG328，分别与Ty-2基因和Ph-3基因紧密连锁，在PCR 体系中同时加入这2对引物扩增后，酶切前产物条带清晰，目的条带符合預期，所有材料均可扩增出500 bp的条带（Ph-3基因酶切前抗感杂3种基因型的条带都是500 bp），另外基因型为ty-2/ty-2 的B：CK2和材料1～3号扩增出一条800 bp 的特异性片段，基因型为Ty-2/Ty-2的A：CK1和材料4～6号扩增出900 bp 的SCAR标记的特异性片段，而基因型Ty-2/ty-2 的材料7～9号还扩增出900、800 bp这2条特异性片段，可见同时加入这2对引物酶切前对扩增产物条带没有影响、互不干扰 （图1）。
　　48卷3期 林 涛等 番茄抗性基因Ty-2和Ph-3多重PCR的检测应用
　　2.2 扩增产物酶切后的特异标记片段
　　为提高效率，同时加入2对引物扩增，20 μL产物加入快切酶，进行25 μL体系的酶切反应，凝胶电泳检测显示结果，以构建Ty-2和Ph-3这2个基因标记的多重PCR 体系。结合表1和图2：2对引物的PCR 条带清晰，材料1与B（CK2）基因型相同，双感对应显示2条特异性条带800、500 bp;基因型为ty-2/ty-2、Ph-3/ph-3的材料2，有800、500 和260 bp 大小的3 条特异性条带;材料3的基因型为ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3，只有2条特异性条带800、260 bp。纯合抗病基因型为Ty-2/Ty-2的A：CK1和材料4～6号的900 bp特异性片段酶切成约550、350 bp的2条带，4号材料（Ty-2/Ty-2、ph-3/ph-3）显示有3条带，5号材料含杂合Ph-3基因酶切成500、260 bp，共有4条带，6号和A（CK1）的基因型为双抗（Ty-2/Ty-2、Ph-3/Ph-3），有550、350 和260 bp 大小的3 条特异性条带。材料7～9号，含杂合Ty-2基因对应有900、800、550和350 bp大小的4条带，加上Ph-3基因对应显示的条带，双杂材料8号最多有6条带。
　　经多次重复试验结果表明，快切酶将纯合Ty-2基因型的特异性片段900 bp切成约550、350 bp的2条带，而杂合Ty-2基因型则表现为900、800、550和350 bp共4条带，感番茄Ty2的800 bp 大小的特异性条带无酶切位点;Ph-3 基因扩增产物酶切结果不受干扰。该多重PCR同时检测2个基因Ty-2和Ph-3时，可以通过分子标记电泳检测显示找到各自的带型，这9份材料跑出对应基因型的9种带型，最多显示有6条带的是双杂材料8号的带型。
　　2.3 同时检测Ty-2和 Ph-3 基因多重PCR体系的优化
　　研究过程中对Taq酶含量、2对引物浓度、退火温度、PCR扩增循环数，以及快切酶用量和酶切时间等因素进行多重PCR技术的优化。最终确定使用前述试验方法中的2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）混合液扩增时，不再增加Taq 酶用量，CAPS标记TG328引物正反引物浓度降为各0.2 μL （10 mmol/L），调整多重PCR退火温度为56 ℃、快切酶酶切反应为10 min，其他条件不变的情况下，可获得清晰可辨的条带。 　　2.4 多重PCR体系的验证与应用
　　用该多重PCR 技术，对24 份番茄材料进行2个基因Ty-2和Ph-3的基因型鉴定（图3，编号1～24表示材料801～824）。材料1、5、8和14带型相同，有550、350 和260 bp 大小的3 条带，其基因型为双抗。材料2、4、13和20均有800、260 bp大小的2条带，表明它们的基因型为ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3;材料3显示的4条带，可知其基因型为Ty-2/Ty-2、Ph-3/ph-3;材料6、7、9～12这6份材料仅有800、500 bp大小的2条带，说明它们的基因型为双感;编号15～19和21～23共8份材料，显示了相同的5条带，表明其基因型为Ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3;材料24的带型表明它的基因型是ty-2/ty-2、Ph-3/ph-3。
　　结合表2，单引物普通PCR鉴定可得材料1、3、5、8和14这5份材料含纯合Ty-2 基因;7、15～19和21～23这9份材料有2条带，说明其含杂合Ty-2基因;800 bp的单条带表明剩余的10份材料基因型是ty-2/ty-2（图4）。番茄晚疫病Ph3基因CAPS标记结果如图5，含有Ph3纯合抗病基因型的材料含有酶切位点，PCR产物酶切后会产生260 bp的特异条带，杂合基因型材料酶切后有500 bp和260 bp的2条特异条带，而纯合感病基因型材料酶切后只有1条长度为500 bp的条带。材料6、7和9～12这6份材料显示只有500 bp的单条带，含纯合感病基因;2份材料有2条带，说明材料3和24含杂合Ph-3基因;其他16份材料均含有纯合抗病基因。
　　上述多重PCR技术检测的材料基因型与单引物普通PCR分别检测所获的基因型进行综合比对，两者最终结果一致，说明选用SCAR标记T0302引物和CAPS标记TG328引物，同时检测Ty-2、Ph-3基因的多重PCR 体系可行性得到进一步验证。结合图2和图3，实际运用读图时，带型显示为6条带的双杂材料和显示800 bp和500 bp这2条带的双感材料首先淘汰，材料双抗基因型组合的带型（显示为3 条带550、350和260 bp ）优先入选，再根据这2个基因的优先顺序进行读图及材料选留，如以检测Ty-2基因优先时先找无800 bp条带的带型，以检测Ph-3基因优先时先找无500 bp条带的带型，这样很容易通过读图判断筛选到目标基因型的材料。
　　3 结论与讨论
　　为快速准确地鉴定筛选到番茄抗性目标基因，要求检测技术必须具有可靠性和操作的便利性。该研究在多重PCR 体系优化研究过程中，对Taq酶含量、2对引物的正反引物浓度、退火温度、PCR扩增循环数，及酶切反应中酶用量和反应时间等条件进行摸索。最终确定多重PCR反应体系为20 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye） 10 μL，SCAR标记正反引物各0.4 μL （10 mmol/L），CAPS标记正反引物各0.2 μL （10 mmol/L），DNA 模板1 μL （100 ng），ddH2O 补足至20 μL。PCR 扩增程序中退火温度为56 ℃，时间1 min，酶切时间调整为10 min，其他条件不变。
　　同时使用2个共显性分子标记的2对引物扩增时，酶切前对扩增产物没有影响，产物经酶切后，可清晰分辨出最多有6条带，而且每个带型条带间距适当、容易区分不同的带型。通过带型可知该多重PCR体系酶切反应，对Ph-3基因的扩增产物酶切结果不变，与该基因单引物普通PCR技术鉴定所得的条带大小相同;而Ty-2纯合抗病基因型900 bp的条带酶切成550和350 bp的2条带、杂合基因型酶切后有900、800、550和350 bp的4条带，但对基因型Ty-2/ty-2和ty-2/ty-2的800 bp的条带没有影响，因此仍可通过带型判断它们的基因型。
　　此多重PCR检测显示结果表明，共有9种带型对应相应的基因型，与单引物普通PCR分别鉴定的基因型综合分析后的结果一致。分子標记技术发展很快，李宗俊等[18]采用委托专业机构检测的方式，使用第三代分子标记技术，利用KASP标记基于已知SNP 检测来辅助番茄育种。然而短期内多数育种者在学习利用新技术的同时，充分应用已有设备和相应技术还是必经阶段。该多重PCR体系的基础是第二代分子标记技术，在实践中，即使带型中部分条带显色较弱，只要掌握一定的认读技巧，也可以通过带型的条带组成判断基因型，它能同时检测番茄抗黄化曲叶病毒病基因Ty-2和抗晚疫病基因Ph-3，且能区分其9种基因型组合，分子标记操作简便实用和省时高效。
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