重庆自育水稻骨干亲本稻瘟病抗性评价及其抗病基因分布分析

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　　摘要：【目的】明确重庆自育水稻骨干亲本的稻瘟病抗性及其抗病基因分布情况，为高效选育抗稻瘟病水稻品种提供优质亲本。【方法】采用病圃自然诱发和人工接种相结合的方法，对重庆地区自育的73份水稻骨干亲本稻瘟病抗性进行鉴定，并利用Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh、Pib、Pita和Pi-km1 7个抗稻瘟病基因的分子标记对其基因型进行检测以分析抗病基因分布和聚合方式。【结果】73份水稻亲本中，田间稻瘟病抗性鉴定为高抗和抗病的亲本（42份）占57.5%，携带抗病基因的水稻亲本（49份）占67.1%，其中仅携带1个抗病基因的亲本有18份，表型高抗的有1份，表型抗病的有7份，抗病比率44.4%;聚合2个抗病基因的亲本有18份，表型高抗的有4份，表型抗病的有6份，抗病比率55.6%，聚合3个抗病基因的亲本有9份，均表型抗病，抗病比率100.0%;聚合4个抗病基因的亲本有4份，表型高抗的有2份，表型抗病的有2份，抗病比率100.0%;不携带检测基因的亲本（24份）占32.9%，其中表型高抗的有3份，表型抗病的有8份，抗病比率45.8%;抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita在携带抗病基因的水稻骨干亲本中分布频率不同，分别为13.7%、31.5%、31.5%、37.0%和19.2%;未检测出含抗病基因Pi9和Pi-km1的亲本，也未检测到同时携带抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita的亲本。不同水稻亲本携带抗病基因不同及聚合方式不同，抗病表现均存在差异。【结论】基因聚合可有效提高亲本的抗病性，但基因聚合后抗病比率并非简单地叠加，应从中筛选田间抗病较强的亲本作为抗稻瘟病育种的候选亲本。
　　关键词： 水稻;骨干亲本;稻瘟病;表型;抗病基因;抗性
　　中图分类号： S511.035.3                        文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0008-08
　　0 引言
　　【研究意义】由灰梨孢（Pyricularia grisea Sacc.）引起的稻瘟病是影响水稻（Oryza sativa L.）生产的主要病害之一，具有发生范围广、传播快、流行频率高、病原菌易变异等特点（孙国昌等，1998;陈利锋和徐敬友，2005），严重威胁水稻高产、稳产（Skamnioti and Gurr，2009;Moyri et al.，2012）。近年来，随着优质杂交稻在重庆地区的大面积推广，感病品种随之增多，加之菌源充足、气候适宜稻瘟病发生等原因，稻瘟病已成为重庆地区水稻最主要的病害。生产实践证明，选育和种植抗稻瘟病水稻品种是防治水稻稻瘟病最经济、有效、环保的措施（Dean et al.，2012;王丽丽等，2017），因此，开展重庆地区自育水稻骨干亲本稻瘟病抗性评价及基因检测对高效选育抗稻瘟病水稻品种及其安全、稳定生产具有重要意义。【前人研究进展】杂交水稻品种的稻瘟病抗性受其亲本稻瘟病抗性影响（黄富等，2007）。传统育种方法是通过主导优良品种与抗性亲本杂交，再将杂交后代在稻瘟病病圃经多代压力选择筛选出抗性品系，以实现抗稻瘟病品种选育。由于缺乏對抗源资源所携带抗稻瘟病基因（Pi）的了解，故在抗性亲本选择上目的性不强，对杂交后代的选择效率也较低。随着现代生物技术的发展，分子标记可快速确定水稻中的抗病基因类型，并利用与之紧密连锁的分子标记进行辅助选择育种，可有效提高选择效率。目前，已报道85个主效抗病基因主要分布在69个抗稻瘟病位点（Deng et al.，2017），其中25个抗病基因已被克隆。此外，大量科研人员利用不同抗稻瘟病基因的分子标记和病圃对水稻资源的稻瘟病抗性进行研究。冷祯陆（2011）、李建修（2012）利用稻瘟病病圃对四川水稻制恢资源的稻瘟病抗性进行评价，结果表明，69.5%的制恢资源表现为高抗稻瘟病，14.1%的制恢资源表现为中抗或抗稻瘟病。李进斌等（2012）利用Pita和Pib抗稻瘟病基因连锁的SSR分子标记对云南地方稻种的抗稻瘟病基因型进行检测，结果表明，Pita基因主要分布于玉溪、保山、临沧、思茅等地区的稻种中，而Pib基因主要分布于滇西部的怒江和昭通地区的稻种中。宋广树等（2016）研究Piz-t、Pi-kh等10个抗稻瘟病基因在吉林主栽品种和优良品系中的分布，结果表明，Pi2、Pi36、Pi37、Pi-kh、Piz-t和Pita基因在吉林省主要推广水稻品种中分布较广泛，而Pi9、Pib、Pi21和Pi-d2基因分布较少。张银霞等（2016）利用Pita、Pi-kh等7个抗稻瘟病基因的SSR分子标记分析宁夏水稻品种的抗稻瘟病基因类型及数量，结果表明，宁夏水稻品种主要含有Pib、Pi-km和Pi9基因，缺乏Pi2和Pita基因。管玉圣等（2017）利用Pi2、Pi5等4个抗稻瘟病基因的SSR分子标记对重庆地区部分水稻亲本材料的抗稻瘟病基因进行检测，明确了Pi2、Pi5等4个抗稻瘟病基因的SSR分子标记对重庆部分亲本材料筛选的有效性。【本研究切入点】不同地区稻瘟病病原菌致病类型不同，且易变异。目前，针对重庆地区特定的病原菌种群，本课题组前期研究已明确了Pi2、Pi5、Pi9和Pi-kh 4个抗稻瘟病基因的SSR分子标记对重庆地区亲本筛选的有效性和抗病基因在亲本中的分布情况（管玉圣等，2017），但水稻携带抗病基因不同，则抗病性不同，且即使携带抗病基因也并不代表表型抗病。因此，有必要对重庆地区水稻亲本的稻瘟病进行田间表型鉴定，辅以分子标记手段，根据抗病性和基因型制定育种策略，以保障水稻的安全、稳定生产。【拟解决的关键问题】以重庆地区自育的水稻骨干亲本为材料，采用自然诱发和人工接种相结合的方式对其稻瘟病（穗颈瘟）进行田间抗病性评价，并利用抗性谱较广的Pi2、Pi5等7个抗稻瘟病基因SSR分子标记检测水稻骨干亲本材料中携带的抗病基因类型和数量，以明确亲本的稻瘟病表型、基因型及其分布、抗病基因不同聚合方式的抗病比率等，为合理利用亲本稻瘟病抗性、高效选育抗稻瘟病水稻品种提供理论基础。 　　1 材料与方法
　　1. 1 试验材料
　　供试水稻材料为重庆地区自育的73份水稻骨干亲本，其中，制保亲本（品种编码2018-B01～2018-B46）46份和制恢亲本（品种编码2018-R01～2018-R27）27份。病圃穗颈瘟鉴定对照水稻品种为丽江新团黑谷。以上水稻材料均由重庆市农业科学院水稻研究所提供。稻瘟病病原菌单孢菌株ZA11和ZB11为近3年重庆地区流行且致病力强的致病菌，由重庆市渝东南农业科学院分离、纯化、鉴定及保存。主要试剂：DNA提取液、三氯甲烷（分析纯）、冰乙醇（分析纯）、70%（v/v）乙醇溶液、1×TE缓冲液、10 g/L琼脂糖溶液和0.5×TBE缓冲液均由重庆市农业科学院水稻研究所提供;引物和PCR反应试剂盒购自TaKaRa公司。主要设备仪器：PCR扩增仪（SensQuest Labcycle）、Gel DOCTM XR+凝胶成像系统（BIO-RAD）、电泳仪（PowerPacTM）、电泳槽、高通量组织研磨器（Scientz.50）和水平摇床（WD-9405B型）。
　　1. 2 试验方法
　　1. 2. 1 稻瘟病菌培养与孢子悬浮液配制 参照付崇允等（2006）的方法，分别采用PDA培养基（去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、1000 mL蒸馏水）和大麦培养基（大麦∶高粱=3∶1）进行稻瘟病菌孢子培养和孢子扩大培养，供产孢备用。收集稻瘟病菌孢子时，先用灭菌水洗脱大麦高粱培养基上生长的稻瘟病菌孢子，再用3层灭菌纱布过滤洗脱液，滤去杂质，最终将孢子悬浮液中的孢子浓度调整至2×105个/mL备用。孢子悬浮液现配现用。接种前等体积混合两种病原菌孢子悬浮液，供田间喷雾接种。
　　1. 2. 2 稻瘟病抗性评价 试验于2015─2017年在重庆市农业科学院水稻所南川区河图乡的稻瘟病抗性鉴定圃（东经107°27′，北纬29°30′，海拔680 m）进行，该地区为重庆市稻瘟病常发区，采用自然发病和人工接种诱发稻瘟病相结合的方法开展抗病性鉴定。试验以每份水稻骨干亲本为一小区，种植株行距16 cm×26 cm，每份亲本2行，每行10株，共20株，各骨干亲本间比法排列，每10份骨干亲本种植2行丽江新团黑谷作为感病对照。病圃四周种植感病水稻3～6行，作为诱发行。于水稻孕穗期至破口期前数天，以背负式喷雾器对目标小区进行ZA11和ZB11菌株孢子悬浮液接种2～3次，每48 h接种1次。水稻整个生育期保持适量的水深，适当增施氮肥，根据病圃害虫、杂草种类和程度使用杀虫剂和除草剂，不使用任何杀菌剂，其他田间管理措施参照常规办法。当感病对照品种丽江新团黑穗颈瘟充分发病时，对目标小区水稻骨干亲本的穗颈瘟进行表型调查。分级标准参照杨秀娟等（2008）的病情指数平均值评判法（表1）。最后，计算抗病比率（表型高抗和抗病亲本的比例）。
　　1. 2. 3 抗稻瘟病基因检测 取水稻骨干亲本分蘖期的嫩绿叶片3～5片，采用改良的CTAB法提取基因组DNA。利用抗稻瘟病基因Pi2、Pi5、Pi9、Pi-kh、Pib、Pita和Pik-m1的连锁SSR分子标记引物（表2）进行PCR扩增。PCR反应体系10.0 μL：DNA模板 1.0 μL、1.0 μL 10×PCR缓冲液（含MgCl2）、10 mmol/L引物1.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL、5 U/mL Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O补足至10.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物加入2.0 μL上样缓冲液充分混匀后，以1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，取出后放入含溴化乙锭的0.5×TBE缓冲液染色3～5 min，最后用凝胶成像系统扫描记录结果。
　　1. 3 统计分析
　　采用Excel 2013对试验数据进行统计分析。
　　2 结果与分析
　　2. 1 水稻骨干亲本的穗颈瘟抗性田间鉴定结果
　　穗颈瘟田间表型鉴定结果如表3所示。虽然供试水稻骨干亲本穗颈瘟表型不同年度间存在一定差异，但整体表型基本一致，在感病～高抗水平间均有分布。其中，高抗和抗病亲本有42份，占供试亲本总数的57.5%;中抗和中感亲本各12份，均占16.4%;感病亲本有7份，占9.6%。
　　2. 2 水稻骨干亲本的基因型检测结果
　　从基因型检测结果（表4）可看出，携带抗病基因的水稻亲本有49份，占供试亲本总数的67.1%;不携带检测基因的水稻亲本有24份，占32.9%;抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita在携带抗病基因的水稻骨干亲本中分布频率各不相同（图1），分别为13.7%、31.5%、31.5%、37.0%和19.2%;未检测出携带抗病基因Pi9和Pi-km1的亲本。
　　将供试亲本的穗颈瘟田间表现鉴定结果（表3）和基因型检测结果（表4）进行综合分析，结果表明，供试亲本携带抗病基因不同及其聚合方式不同，抗病表现均存在差异。具体表现：仅携带Pi2基因的亲本有1份，表型为抗病;仅携带Pi5基因的亲本有4份，其中表型高抗的有1份，表型抗病的有2份，表型中抗的有1份;仅携带Pib基因的亲本有4份，表型抗病的有2份，表型中抗和中感的各有1份，仅携带Pi-kh基因的亲本有5份，表型抗病的有2份;表型中感的有1份，表型感病的有2份;仅携带Pita的亲本有4份，表型中抗的有1份，表型中感的有2份，表型感病的有1份;携带Pi2+Pi-kh、Pi2+Pib、Pi-kh+Pita、Pi5+Pi-kh基因的亲本各1份，其中前三者表型为抗病，后者表型为中感;携带Pi5+Pib基因的亲本有7份，其中表型高抗的有2份，表型抗病的有2份，表型中抗的有3份;携带Pi5+Pita基因的亲本有3份，表型高抗、中抗和感病的亲本各1份;携带Pi-kh+Pib基因的亲本有2份，表型高抗和中感各1份;携带Pib+Pita基因的亲本2份，表型抗病和中感各1份;携带Pi2+Pi-kh+Pib和Pi5+Pi-kh+Pib基因的亲本均有3份，均表型抗病;携带Pi-kh+Pib+Pita、Pi5+Pi-kh+Pita、Pi2+Pi5+Pi-kh基因的亲本各1份，均表型抗病;携带Pi2+Pi5+Pi-kh+Pib基因的有2份，均表型高抗;携带Pi2+Pi-kh+Pib+Pita基因的亲本有1份，均表型抗病;携带Pi5+Pi-kh+Pib+Pita基因有1份，表型为抗病。 　　2. 3 抗稻瘟病基因数量及聚合亲本的抗病性分析结果
　　由表5可看知，不携带抗病基因的水稻亲本有24份，其中表型高抗的有3份，表型抗病的有8份，抗病比率为45.8%;仅携带1个抗病基因的水稻亲本有18份，其中表型高抗的有1份，表型抗病的有7份，抗病比率为44.4%;聚合2个抗病基因的水稻亲本有18份，其中表型高抗的有4份，表型抗病的有6份，抗病比率为55.6%，聚合3个抗病基因的水稻亲本有9份，均表型抗病，抗病比率为100.0%;聚合4个抗病基因的水稻亲本有4份，其中表型高抗的有2份，表型抗病的有2份，抗病比率为100.0%。
　　从抗病比率分析结果（图2）来看，仅携带一个抗病基因的供试亲本中，携带Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita基因的亲本分别有1、4、4、5和4份，抗病比率分别为100.0%、75.0%、40.0%、50.0%和0%;聚合2个抗病基因的供试亲本中，携带Pi5+Pib基因的亲本最多（7份），抗病比率达57.1%;以携带Pi2+Pib、Pi2+Pi-kh和Pi-kh+Pita的亲本均有1份，抗病比率均为100.0%;在聚合3个抗病基因的供试亲本中，携带Pi2+Pi-kh+Pib和Pi5+Pi-kh+Pib基因的亲本均有3份，抗病比率均为100.0%;聚合4个抗病基因的供试亲本有4份，分别是携带Pi2+Pi5+Pi-kh+Pib基因（2份）和Pi2+Pi-kh+Pib+Pita基因（2份），抗病比率均为100.0%;未检测到同时携带5个抗病基因的亲本。
　　3 讨论
　　3. 1 抗稻瘟病基因在水稻亲本中分布情况
　　选育与推广种植抗病品种是防治稻瘟病最经济、有效、环保的措施（Dean et al.，2012;王丽丽等，2017），筛选抗稻瘟病水稻亲本是其重要基础工作。本研究对7个抗稻瘟病基因的SSR分子标记进行检测发现，抗病基因Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita在携带抗病基因的亲本中分布频率不同，其中Pib基因的分布频率最高（37.0%），其次是Pi5（31.5%）基因和Pi-kh（31.5%），Pi2的分布频率最低（13.7%），未检测出携带抗病基因Pi9和Pi-km1的亲本，说明Pib基因可能广泛存在于各类水稻材料中，与李进斌等（2012）、王丽丽等（2017）的研究结果相似，但Pi9作为抗谱较广的抗稻瘟病基因，且与Pi2、Pi-kh基因同时被确认是西南稻区四川地区有效的抗稻瘟病基因（张雪梅，2011），在本研究供试水稻材料中尚未检测出，推测是种质的地域局限性所致，应加强含该抗病基因亲本的引、育、选种工作。
　　3. 2 不同抗稻瘟病基因的抗病效应分析
　　已有研究证实，聚合多个抗稻瘟病基因有利于拓宽品种的抗谱，进而提高抗病性，可作为培育稻瘟病持久抗性的有效方法（张银霞等，2016）。本研究以从重庆地区分离得到的稻瘟病病原菌主要优势生理小种ZA11和ZB11为致病菌，利用7个抗稻瘟病基因分子标记检测73份水稻骨干亲本的抗病基因型，并鉴定其田间穗颈瘟抗性，结果发现，聚合抗病基因Pi2+Pib、Pi2+Pi-kh和Pi-kh+Pita的亲本和聚合3个及以上抗病基因的亲本抗病比率均为100.0%，表明基因聚合可有效提高亲本的抗病性，與张银霞等（2016）的研究结果相似。但王丽丽等（2017）研究发现，辽宁地区水稻资源抗稻瘟病基因聚合与抗病性并非完全正相关。本研究发现在仅携带单个抗病基因的亲本中，携带Pi2、Pi5、Pi-kh、Pib和Pita抗病基因的亲本抗病比率分别为100.0%、75.0%、40.0%、50.0%和0%，在聚合2个抗病基因的亲本中，Pi5+Pib（57.1%）、Pi5+Pi-kh（0%）和Pi5+Pita（33.3%）的抗病比率小于或远小于携带单个抗病基因Pi5亲本的抗病比率（75.0%），说明抗病基因Pi5聚合后抗病性反而减弱，推测基因聚合后抗病比率不是简单地叠加。这与王丽丽等（2017）的研究推论相似。
　　稻瘟病是水稻上毁灭性真菌病害，符合经典的基因对基因假说（Jia et.al，2000）。本研究发现，在24份不携带抗病基因的亲本中，有9个亲本表现抗病，推测这些亲本中含有本研究7个抗稻瘟病基因以外的其他抗稻瘟病基因，且环境因素对亲本抗病性存在影响，具体原因有待进一步探究。
　　4 结论
　　基因聚合可有效提高亲本的抗病性，但基因聚合后抗病比率不是简单地叠加，应从中筛选出田间抗病性较强的亲本作为抗稻瘟病育种的候选亲本。
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　　（责任编辑 陈 燕）
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