柽柳cpSSR—PCR反应体系的建立和优化

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　　摘要 [目的]建立并优化柽柳cpSSR-PCR反应体系和反应条件。[方法]对影响PCR反应的5个变量（Mg2+ 浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA浓度）进行L16（45）正交试验设计，并对引物退火温度进行梯度筛选。[结果]最优反应体系：Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTPs 0.125 mmol/L、Taq DNA聚合酶 0.25 U、引物 0.25 μmol/L、模板 DNA 20 ng，共10 μL。反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，引物退火温度30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。[结论]该反应体系成功扩增1个柽柳天然群体的23个个体，为柽柳群体扩散路线的确定奠定基础。
　　关键词 柽柳；叶绿体微卫星；反应体系；正交试验
　　中图分类号 S718.4 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）09-0105-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.031
　　Abstract [Objective] To establish and optimize the cpSSRPCR reaction system and amplification condition of Tamarix chinensis. [Method] L16（45） orthogonal design was used to identify the optimum Mg2+ concentration， dNTPs concentration， Taq concentration， primers concentration， and DNA concentration for cpSSRPCR amplification of T. chinensis ， and gradient annealing temperature test was also conducted. [Result] The optimized system was as follows： a 10 uL reaction volume including 2.0 mmol/L Mg2+， 0.125 mmol/L dNTPs， 0.25 U Taq ， 0.25 μmol/L primers， 20 ng DNA. The suitable procedure was 4 min denaturation at 94 ℃， followed by 30 cycles of 30 s denaturation at 94 ℃， 30 s annealing step at 56.5 ℃， 30s elongation at 72 ℃， and a final extension step at 72 ℃ for 10 min. [Conclusion] The optimized cpSSRPCR system successfully amplified the 23 individuas from a natural T. chinensis population and could be applied to study on population dispersal of T. chinensis.
　　Key words Tamarix chinensis Lour.；Chloroplast microsatellites；Reaction system；Orthogonal design
　　檉柳（Tamarix chinensis Lour.）属柽柳科柽柳属，是起源于旧大陆的古老植物，为3～6 m的灌木或小乔木。柽柳科隶属于双子叶植物纲五桠果亚纲，分有3属：红砂属、水柏枝属、柽柳属，世界分布约126种植物，其中柽柳属90种[1]。我国是柽柳属植物的一个次级起源中心和分布中心，拥有18个种1个变种，许多为我国特有种，其中新疆分布有16个种[2]。柽柳耐盐碱和水湿，是沿海滩涂的重要生态防护树种[3]。柽柳自19世纪上半叶被美国自亚洲引进后，在美国西部大面积扩张建群，甚至替代了原生植被，被划为入侵树种[4]。
　　柽柳是柽柳属植物中在我国分布最广的一个种，天然分布于内蒙、北京、河北、河南、山东、江苏（北部）、浙江等省。目前在华东和华南部分省份发现有人工群体或小面积栽培。基于植物地理学研究认为柽柳自新疆次级分布中心向东扩散，但柽柳孢粉学证据较缺乏[5]，且又不连续，对小尺度的柽柳群体扩散路线较难进行推断。叶绿体DNA为单亲遗传（被子植物大多为母系遗传）的环状DNA，进化速率慢，遗传变异的研究能在分子水平上重建植物的建群路线、鉴别栽植群体的材料来源[6]。笔者研究了柽柳叶绿体微卫星反应体系的建立，以期为柽柳群体扩散路线确定、柽柳不同品种遗传来源鉴别提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　柽柳采自位于山东省昌邑柳疃镇盐场附近的柽柳天然群体（119°21′22″ E、37°05′16″N）。为避免相关性采样，所采植株尽量间隔50 m以上，由于群体受到人为破坏，共采取23株个体。选取植株中部成熟叶3～5 g放入装有硅珠的自封袋中，带回实验室保存于-80 ℃超低温冰箱以备后序试验。采用改良的CTAB法[7]提取DNA，用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳进行定性和定量检测。提取的DNA检测后统一稀释至20 ng/μL。
　　1.2 引物合成和PCR反应试剂
　　所用柽柳叶绿体微卫星引物为南京林业大学林木遗传育种实验室自行开发。引物上游序列：TCCCGGACGTAAGATCCTG，下游序列：ATCGTGGGACCGATTCGAAT，重复单元为（TG）5，目的片段长度181 bp。由南京金斯瑞生物公司合成引物，其他PCR反应试剂如Taq酶、dNTPs、Mg2+和Buffer均购自 TaKaRa 公司。50 bp DNA Marker购自天根生化科技有限公司。 　　1.3 PCR扩增和产物电泳分离
　　PCR扩增反应程序为南京林业大学林木遗传育种实验室设计的柽柳核叶绿体基因组SSR 的PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃30 s，引物退火温度30 s，72 ℃30 s，30个循环；72 ℃延伸45 min；16 ℃保存。PCR产物采用8%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。量取50 mL变性胶液（含21 g尿素，3.9 g丙烯酰胺，0.1 g甲叉双丙烯酰胺；1×TBE浓度），加入180 μL APS（10%过硫酸氨）和35 μL TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）后灌胶。PCR扩增产物加入4 μL上样缓冲液（0.25%溴酚兰，15%聚蔗糖），取1.5 μL混合液点在凝胶梳孔里，200 V恒电压电泳90 min左右至溴酚兰跑出凝胶，所用仪器为北京六一仪器厂DYCZ-30c型电泳槽。胶板在固定液（10%乙醇100 mL+0.5 mL纯乙酸）固定10 min，AgNO3溶液（浓度为0.15%）银染8 min，倒入显影液（100 mL配方：1.5 g氢氧化钠+1 mL 0.756%的四硼酸钠+1 mL甲醛）直至显出清晰的条带，检测分离结果。
　　1.4 正交试验设计和引物退火温度筛选
　　对PCR反应体系中的DNA模板浓度、引物浓度、dNTPs、Mg2+浓度和DNA Taq酶浓度进行5因素4 水平正交试验设计L16（45）（表1），每种处理统一加10×PCR Buffer 1 μL。随机选取2个柽柳DNA模板进行温度梯度设计，梯度值设为1.5 ℃，退火温度50.0～60.5 ℃，共设8个温度梯度。
　　1.5 cpSSR-PCR扩增体系的群体检测
　　运用正交设计得到的最优反应体系和最佳引物退火温度对所采群体进行扩增初试，检验所选扩增体系和退火温度能否有效进行群体扩增。
　　2 结果与分析
　　2.1 柽柳DNA提取
　　改良的CTAB法能够提取质量好的柽柳基因组（图1）。琼脂糖凝胶电泳检测该方法所提取的柽柳DNA谱带清晰、明亮、无拖尾，所提DNA在23 130 bp左右，表明所提DNA质量好，浓度较高，经紫外分光光度计检测OD260/280在1.8～2.0，浓度在100～200 ng/μL，能够满足后续试验的要求。
　　2.2 cpSSR-PCR正交试验结果
　　基于正交试验设计的不同PCR反应组合之间存在较大差异（图2），多数反应组合（C、D、F、G、H、I、J、K、L、N及O等12组合）仅1个模板得到有效扩增，有的反应组合（如A、B及P等3组合）2个模板都不能得到有效扩增。仅E、M 2个组合有效扩增了2个供试模板，但M组合所扩增产物条带模糊，E组合扩增产物清晰、产物丰度高，故选择E组合为柽柳叶绿体SSR扩增反应体系，其各反应组分：Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTPs 0.125 mmol/L、Taq DNA聚合酶 0.25 U、引物 0.25 μmol/L、模板 DNA 20 ng。
　　2.3 退火温度筛选
　　柽柳叶绿体SSR引物在一定退火梯度范围内，目的产物均能得到扩增，但产物的丰度和特异性存在差异（图3）。较低的退火温度（如A、B、C 3个较低的温度梯度）导致非特异性扩增较多，随着退火温度的增加，非特异性扩增减少，但较高的退火温度（如G、H 2个温度梯度）扩增的产物丰度降低，综合8种退火温度梯度处理，选择E（56 ℃）为该引物退火温度。该退火温度下扩增产物丰度高、条带清晰、杂带较弱，等位基因比较容易判读，2个模板的扩增产物具有相对一致的丰度。
　　2.4 反应体系的群体检测
　　采用筛选出的cpSSR-PCR反应体系和退火温度（56 ℃）对所采群体进行检测，结果表明，所采用的反应体系能够有效扩增叶绿体目的片段（图4）。扩增的目的片段清晰，几乎无杂带，产物丰度相对一致，等位基因容易判读，可为柽柳群体的大规模扩增提供分子试验基础。
　　3 结论与讨论
　　在16种正交组合中，除第5种和第13种组合能有效扩增2个模板DNA外，其他组合仅能对1个模板DNA进行目的片段的有效扩增，表明试验设计的各PCR反应组合比较灵敏，能够反映各PCR反应组分对柽柳叶绿体微卫星对目的DNA扩增效果。该试验退火温度能在较大的温度范围内有效扩增目的片段，只是有丰度上略有差别；另试验中较低的退火温度（A、B和C 3个温度梯度）导致非特异性扩增的增加，这已在其他研究中得到证实[8-9]。DNA模板浓度在试验中对各反应底物浓度组合较不敏感，这与郭海林等[10]对结缕草植物的SSR扩增与邵俊培等[11]对马尾松的PCR-SSR反应体系优化结果一致。该研究采用所选cpSSR-PCR反应体系及退火温度能够对昌邑群体进行成功扩增，表明正交设计得到的反应体系能夠进行柽柳群体的检测，可为进一步柽柳分子地理系统学研究奠定基础。
　　参考文献
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