两种荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比较与评价

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　　摘要：目的  探討两种乙型肝炎病毒DNA试剂检测HBV-DNA的相关性，分析其检测结果的差异性。方法  使用凯杰试剂与之江试剂检测75例患者血清中的HBV-DNA水平，凯杰试剂采用手工提取样本中的DNA，之江试剂采用自动核酸提取仪提取DNA，然后进行核酸扩增。对HBV-DNA病毒载量进行对数转换（lg10），并将两组数据进行相关性分析;对不一致的结果采用罗氏试剂进行确证。结果  以HBV-DNA含量>5.0×102 IU/ml临界值，拟合两组检测数据结果，相关方程为Y=0.8889X+0.7956（R2=0.8954，P<0.05）;凯杰试剂检测标本中HBV-DNA含量为[（5.07±1.96）（对数值）]，之江试剂检测结果为[（5.30±1.84）（对数值）]，差异有统计学意义（P<0.05）。凯杰试剂检测阳性率为57.33%（43/75），低于之江试剂的73.33%（55/75），差异有统计学意义（P<0.05）。15例检测结果不一致的样本中，凯杰试剂与罗氏试剂结果符合率为37.50%，之江试剂与罗氏试剂检测结果符合率为62.50%。结论  凯杰试剂与之江试剂相关性良好，其检测结果可以比较，且之江试剂检测HBV-DNA的敏感性高于凯杰试剂。
　　关键词：荧光定量PCR;乙肝病毒;凯杰试剂;之江试剂;罗氏试剂
　　中图分类号：R512.62;R440                             文献标识码：A                           DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.06.057
　　文章编号：1006-1959（2019）06-0174-03
　　Abstract：Objective  To investigate the correlation between two hepatitis B virus DNA reagents for detecting HBV-DNA and analyze the differences in their detection results. Methods  The levels of HBV-DNA in the serum of 75 patients were detected by using Kaijie reagent and Zhijiang reagent. The Kaijie reagent used manual extraction of DNA from the sample. The Zhijiang reagent used an automatic nucleic acid extractor to extract DNA and then perform nucleic acid amplification. The HBV-DNA viral load was log-transformed （lg10）， and the two sets of data were correlated. The inconsistent results were confirmed by Roche reagent.Results  The HBV-DNA content>5.0×102 IU/ml threshold value was used to fit the results of the two groups. The correlation equation was Y=0.8889X+0.7956 （R2=0.8954， P<0.05）.The HBV-DNA content in the Kaijie reagent test specimens was [（5.07±1.96） （logarithmic value）]， and the Zhijiang reagent test result was [（5.30±1.84） （logarithmic value）]， the difference was statistically significant （P<0.05）. The positive rate of Kaijie reagent detection was 57.33%（43/75）， which was lower than that of Zhijiang reagent 73.33%（55/75）.The difference was statistically significant （P<0.05）. Among the 15 samples with inconsistent test results， the coincidence rate of Kaijie reagent and Roche reagent was 37.50%， and the coincidence rate between Zhijiang reagent and Roche reagent was 62.50%.Conclusion  Compared with the two reagents， the correlation is good and the test results can be compared. The sensitivity of Zhijiang reagent to detect HBV-DNA is higher than that of Kaijie reagent. 　　Key words：Fluorescence quantitative PCR;Hepatitis B virus;Kaijie reagent;Zhijiang reagent;Roche reagent
　　乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type B）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的传染病，是一种严重危害人类健康的传染病。全球约20亿人感染乙肝，其中约2.4亿人感染慢性乙肝，我国属乙肝高流行国家，有9千万乙肝病毒感染者[1]。肝癌起源于肝细胞，与慢性肝脏疾病引起的肝硬化高度相关，乙肝是导致肝癌发生最重要的危险因素之一[2]。定量测定乙肝病毒核酸（HBV-DNA）是乙肝诊断、抗病毒治疗疗效观察及用药指导的重要指标[3]。实时荧光定量PCR技术检测HBV-DNA是目前特异性较好，灵敏度较高的方法。本研究采用两种HBV-DNA实时荧光定量PCR试剂检测患者血液标本，旨在比较它们之间的差异性和相关性。
　　1材料与方法
　　1.1材料  收集2017年2月在四川省遂宁市中心医院检验科做HBV-DNA定量检测血清标本75例，将标本按4000 r/min离心5 min，留取血清冷冻于-80℃冰箱保存。
　　1.2仪器与试剂  试剂A由凯杰生物工程（深圳）有限公司提供;试剂B及EX3600核酸自动提取仪由上海之江生物科技有限公司提供;試剂C由罗氏诊断产品有限公司提供。试剂A、B用罗氏Cobas z480扩增仪进行检测，试剂C用罗氏Cobas AmpliPrep/Cobas Taqman 96系统检测，实验所用试剂在有效期内。
　　1.3方法  将75例血清标本分别用试剂A、B进行平行检测，试剂A采用人工提取核酸和实时荧光定量检测技术;试剂B采用仪器自动提取核酸和实时荧光定量检测技术;对不一致的样本（以5×102 IU/ml为临界值）采用试剂C检测系统进行确证。
　　1.4统计学处理  对采用试剂A、B检测HBV-DNA载量同时大于5×102 IU/ml的数据进行对数转换（log10），用SPSS17.0软件进行配对t检验、？字2检验和相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1两种试剂检测结果相关性分析  将试剂A、B的检测结果取对数后做相关分析。通过分析曲线可以看出线性良好，相关方程为Y=0.8889X+0.7956 （R2=0.8954，P<0.05），见图1。
　　2.2两种试剂对不同样本的病毒载量分析  试剂A检测标本中HBV-DNA含量为[（5.07±1.96）（对数值）]，试剂B检测标本中HBV-DNA含量为[（5.30±1.84）（对数值）]，差异有统计学意义（t=-2.29，P=0.028）。
　　2.3两种试剂检测阳性率比较  以5×102 IU/ml为临界值，>5×102 IU/ml为阳性，<5×102 IU/ml为阴性。试剂A检测阳性率为57.33%（43/75），试剂B检测阳性率为73.3%（55/75），差异有统计学意义（？字2=15.539，P=0.000），见表1。
　　2.4不一致样本与罗氏检测系统的符合率比较  将试剂A、B检测结果不一致的16例样本（4例样本标本不足未检测），以试剂C罗氏检测系统进行确证。试剂A与试剂C的符合率为37.50（6/16），试剂B与试剂C的符合率为62.50%（10/16），见表2。
　　3讨论
　　实时荧光定量PCR是将荧光能量传递技术应用于常规PCR仪中，在PCR反应体系中加入荧光基团或荧光染料，利用荧光信号积累，实时检测整个PCR过程，目前在临床诊断试剂中，应用最广的是以Taqman荧光探针为基础的实时荧光PCR技术。具有特异性好、灵敏度高、线性关系好、线性范围宽、操作简单安全、速度快效率高等优点。HBV-DNA定量可准确地反映患者体内的病毒复制情况，目前监测HBV-DNA定量的试剂种类繁多，质量残差不齐，在应用临床之前需要对其性能做出评价，为临床提供准确的检测结果。
　　本文探讨了不同厂家试剂的检测结果是否存在差异，对结果进行了比较分析。本次研究结果显示，试剂A与试剂B线性相关性良好（R2=0.8954），检测结果可以相关比较，都可较准确反映患者体内HBV-DNA水平。试剂A（5.07±1.96）与试剂B（5.30±1.84）比较，差异有统计学意义（P<0.05），试剂A检测标本中的HBV-DNA含量低于试剂B检测值。原因可能为试剂A为煮沸法，手工提取核酸，操作步骤繁琐，容易造成核酸的丢失，导致HBV-DNA含量降低。试剂B采用仪器磁珠分离技术，核酸提取由仪器自动完成，可以降低由于手工操作不当等原因造成的假阴性。也可能与两试剂的核酸提取液、反应体系和扩增程序不同有关。以5×102 IU/ml为界值，试剂A阳性率为57.33%（43/75），低于试剂B的阳性率73.33%（55/75）。可能对于低值样本，仪器自动提取核酸的方法明显优于手工提取的方法，灵敏度高于手工提取的方法。对于试剂A与试剂B检测结果不一致的16例样本，采用试剂C（罗氏检测系统）进行确证。国际公认罗氏试剂为检测HBV-DNA定量的参比试剂[4]。试剂A与试剂C符合率为37.50%，低于试剂B与试剂C的符合率62.50%;试剂C检出的8例阳性标本中，试剂B检出了7例，而试剂A只检出了1例，阳性检出率远低于B试剂。这可能是由于试剂B与试剂C同为仪器磁珠提取核酸的方法，它们之间的符合率较高，灵敏度也较一致，进一步提示仪器法的优越性。但由于样本量较小，需进一步探讨。
　　综上所述，凯杰检测试剂与之江检测试剂相关性良好，可以相互替代，但手工操作与仪器磁珠自动提取核酸方法在检测HBV-DNA含量之间存在有统计学差异。建议有条件的实验室尽量使用仪器磁珠的方法，以避免漏检。
　　参考文献：
　　[1]孙波.乙型肝炎流行病学特点及防治策略的研究[J].中国卫生产业，2016，13（8）：81-83.
　　[2]沈艺南，朱峰锋，卢军华.乙肝相关肝细胞癌的分子机制研究新进展[J].现在肿瘤医学，2015，23（8）：1156-1159.
　　[3]王希涛.两种乙肝病毒DNA 实时荧光定量检测试剂的比较[J].国际检验医学杂志，2014，35（6）：754-758.
　　[4]张玥，田文君，刘文庆，等.国产和进口荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的比对分析[J].检验医学与临床，2015，12（2）：147-150.
　　收稿日期：2018-9-28;修回日期：2018-11-25
　　编辑/钱洪飞
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