南洋楹溃疡病菌巢式PCR快速检测

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　　摘  要：由可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）引致的溃疡病是目前威胁南洋楹健康生产和品质的重要病害。快速、准确检测病原菌是进行病害有效防控的基础。本研究用南洋楹溃疡病菌翻译延伸因子（EF 1-α）编码基因上保守靶基因区域的序列设计特异性引物EF-AF/AR。利用EF 1-α编码基因通用引物EF-688F/986R和特异性引物EF-AF/AR组合进行巢式PCR扩增，获得264 bp的单一条带，灵敏度检测最低限度为1 fg/?L。利用建立的巢式PCR方法对林间疑似溃疡病的病样进行检测，能够特异性地检测到L. theobromae。本研究建立的巢式PCR检测方法准确、特异且灵敏性高，可为南洋楹溃疡病的早期诊断和及时防控提供基础的理论和实践依据。
　　关键词：南洋楹溃疡病;可可毛色二孢;巢式PCR
　　中图分类号：S432.4      文献标识码：A
　　Abstract： A rapid nested-PCR detection system for Falcataria moluccana stem canker disease was established. The outer pair of primers EF-688F/986R and the inner pair of primers EF-AF/AR were designed based on the EF 1-α gene sequences of Lasiodiplodia theobromae. The established specific nested-PCR could amplified a single product of 264 bp with annealing temperature of 63 ℃， reaction cycles of 37. The lowest detectable concentration was 1 fg/?L. L. theobromae could be specifically detected by nested-PCR from the diseased plant samples. The establishment of rapid， sensitive nested-PCR detection system of L. theobromae might have significance in early diagnosis， and disease control of F. moluccana stem canker.
　　Keywords： Falcataria moluccana stem canker; Lasiodiplodia theobromae; nested-PCR
　　南洋楹（Falcataria moluccana）是世界著名的热带速生树种，树形美观，木质纤维丰富，韧性强，材质轻，经营周期短，是家具、造纸制浆等的优良原料。此外，其用途十分广泛，经济效益和景观价值高。南洋楹原产地为马来西亚马六甲和印尼马鲁古群岛，我国于1940年前后引种该树种。目前，在广东、广西、海南和福建等地广泛种植[1]。有关南洋楹病害的相关研究报道较少。Colletotrichum truncatum和C. capsiciaa能够侵染南洋楹1年生的小树，引起炭疽病[2]。由Urom?ycladium tepperianum引起的瘤锈病对马来西亚、印尼等地的南洋楹健康生产造成威胁，病树的枝叶形成众多瘿瘤，树冠大量落叶落枝，植株生长受阻[3]。南洋楹丛枝病由类菌原体（MLO）引起，既为害幼树，也为害老树，病树腋芽或侧芽大量萌发，节间缩短，丛枝状，发病后期，枝条干枯，植株死亡[4]。广东已建成我国最大的南洋楹用材林基地，随着广东省内南洋楹无性系的大面积推广种植，南洋楹病害的发生有所增加。近年，由可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）引起的溃疡病在广东博罗等地的南洋楹种植区普遍发生，严重影响南洋楹的健康生产和品质。可可毛色二孢主要为害1～2年生的南洋楹幼树，早期症状不明显，有的叶黄;随着病原菌侵染、扩展，病树茎干呈现典型的黑褐色凹陷、溃疡大病斑，病树明显生长不良，顶枯，严重时整株死亡[5]。
　　准确、快速的检测病原菌是制定病害有效防控措施的重要基础。南洋楹溃疡病早期林间自然发病不易被发现，待其典型症状出现后，再采取防治措施往往为时已晚。采用常规组织分离、培养及病原菌形态鉴定的方法较费时，且对溃疡病早期不显症病样难以诊断。随着溃疡病为害的蔓延加重，南洋楹生产一线亟需快速的溃疡病菌检测体系的建立及应用，但有关南洋楹病害的分子检测尚未见相关报道。本研究基于真菌翻译延伸因子（elongation factor 1-α， EF1-α）序列建立南洋楹溃疡病菌的灵敏、特异的快速分子检测体系，及时检测南洋楹溃疡病的发生及发展，为南洋楹的健康生产及病害防控提供基础的理论依据和材料。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　供试菌株：南洋楹溃疡病菌可可毛色二孢菌株BL1331和HD1332，由华南农业大学植物病理生理学研究室分离、纯化并保存。
　　1.2  方法
　　1.2.1  供试菌株的致病力测定  将保存在?80 ℃冰箱里的南洋楹溃疡病菌菌株BL1331和HD1332接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar， PDA）上，25 ℃恒温培养。选取生长良好、树干笔直的健康南洋楹1年生小树（无性系T18）为接种植株。在植株主干距地面50 cm以上部位选取3个点作为接种点（2点之间相距不少于30 cm），无菌水清洁树皮表面，用灭菌的打孔器在树干上打取接种孔（d=9 mm），去掉表皮。从PDA上培养3 d的供试菌株菌落的边缘打取菌饼（d=9 mm）贴在接种孔上（带有菌丝的一面向内），每个菌株接种4棵树，每棵树接种3个点，以接种无菌PDA培养基块为对照，接种后用无菌湿潤棉外加保鲜膜包裹保湿。接种7 d后定期观察记录发病情况。 　　1.2.2  真菌基因组DNA提取  将供试菌株在PDA上培养2 d后，切取菌落边缘菌丝块转接于PDB培养液中，28 ℃、120 r/min摇床培养3～5 d，真空抽滤收集菌丝体，置于研钵液氮研磨。采用OMEGA Fungal DNA Kit提取真菌菌丝DNA，?20 ℃保存备用。
　　1.2.3  特异性引物设计  利用通用引物EF- 688F/986R（EF-688F：5-CGGTCACTTGATCTAC- ?AAGTGC-3和EF-986R：5-TACTTGAAGG?AA?C- CCTTACC-3）对供试菌株BL1331进行扩增并测序，将测序结果与GenBank中其他相关真菌的EF 1-α基因序列进行比较分析，依据差异性位点设计特异性引物EF-AF/AR（EF-AF：5-GAG?AA?GTTC-GAGAAGGTCCGTGCAC-3和EF-AR：5- CGTTA-GCCATTGCTCGTACGACGAT-3），预期扩增片段的大小为264 bp。引物由华大基因有限公司合成。
　　1.2.4  特异性引物EF-AF/AR的PCR反应退火温度优化  以供试菌株BL1331基因组DNA为模板，将反应温度依次设为55、59、63、67和71 ℃进行梯度实验，反应循环数为35个循环，以确定特异性引物EF-AF/AR的PCR反应的最佳退火温度。
　　1.2.5  特异性引物EF-AF/AR的PCR反应循环数优化  以供试菌株BL1331基因组DNA为模板，将反应循环数依次设为22、27、32、37和42个循环数进行梯度实验，退火温度为63 ℃，以确定特异性引物EF-AF/AR的PCR反应的最佳循环数。
　　1.2.6  巢式PCR反应体系建立  特异性引物EF-AF/AR与通用引物EF-688F/986R组成巢式引物。采用引物EF-688F/986R进行第1轮扩增。反应体系为：DNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs混合液（2.5 mmol/L）4 μL，rTaq聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，引物EF-688F/986R（10 μmol/L）各0.5 μL，灭菌超纯水补足50 μL。反应程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共25个循环，72 ℃延伸10 min。
　　采用特异性引物EF-AF/AR进行第2轮扩增。反应体系为：DNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs混合液（2.5 mmol/L）4 μL，rTaq聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，引物EF-AF/AR（10 μmoL/L）各0.5 μL，灭菌超纯水补足50 μL。反应程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸18 s，共37个循环，72 ℃延伸7 min。
　　1.2.7  巢式PCR特异性检测  以供试菌株BL1331和HD1332为靶标菌，以南洋楹上常见真菌及林木上常见的病原真菌作为参考菌株：皱赤壳（Rugonectria rugulosa）、拟盘多毛孢（Pes?talotiopsis sp.）、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）、小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum）、七叶树壳梭孢（Fusicoccum aesculi）、炭角菌（Xylaria sp.）、荔枝霜疫霉（Peronophythora litchii）。以无菌水为空白对照。
　　1.2.8  巢式PCR灵敏性检测  以供试菌株BL?1331的基因组DNA为模板，DNA模板经浓度测定后稀释，获得质量浓度梯度依次为1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL、10 ag/μL的模板，进行巢式PCR扩增，以无菌水为空白对照。
　　1.2.9  林间疑似病样的巢式PCR检测  随机抽取5份林间采集的南洋楹溃疡病疑似病样，采用OMEGA E.Z.N.A.TM Plant DNA Kit提取植物组织DNA，以健康南洋楹植株样本组织的DNA为阴性对照，以南洋楹溃疡病菌菌株BL1331和HD1332基因组的DNA为阳性对照，以无菌水为空白对照。
　　1.2.10  PCR产物序列分析  PCR扩增产物经2 %琼脂糖凝胶电泳检测，送至华大基因有限公司测序，将测序结果在GenBank中进行BLAST分析。
　　2  结果与分析
　　2.1  供试菌株的致病力测定
　　利用南洋楹溃疡病菌菌株BL1331和HD1332接种南洋楹进行致病力测定（图1）。结果表明：2个菌株均具有较强的致病力，能够引起健康的南洋楹发病，接种10 d后，接种孔附近褐变，接种40 d时，菌株BL1331和HD1332分别在接种处形成（5.0～5.5）×（1.5～2.1） cm及（3.5～4.1）×（1.2～ 1.6） cm的大病斑，病斑暗褐色、长椭圆形或不规则形。菌株BL1331的致病力稍强于菌株HD1332。病斑继续扩展，颜色变深至黑褐色，70 d后，黑褐色大病斑明显凹陷，有的病斑表面纵裂，呈现烂皮（图1）。挑选病斑进行病组织的分离，纯化获得的病原菌经鉴定與接种的病原菌一致。而对照处理无病斑扩展，接种孔处的伤口很快愈合。 　　A：对照;B：菌株BL1331接种70 d后发病症状;
　　C：菌株HD1332接种70 d后发病症状。
　　2.2  特异性引物EF-AF/AR的PCR反应退火温度优化
　　以南洋楹溃疡病菌菌株BL1331的基因组DNA为模板，在退火温度为55、59、63、67、71 ℃条件下，均能获得单一目标扩增条带（264 bp）（图2），但在退火温度为63 ℃条件下扩增条带最亮，而在退火温度为71 ℃条件下扩增条带暗淡。为获得稳定扩增，确定特异性引物EF-AF/AR的PCR反应最佳退火温度为63 ℃。
　　2.3  特异性引物EF-AF/AR的PCR反应循环数优化
　　以南洋楹溃疡病菌菌株BL1331的基因组DNA为模板，在反应循環数为22、27、32、37和42的条件下进行优化（图3），在循环数为22～42的条件下均有单一目标扩增条带（264 bp）产生，在循环数为37的条件下扩增条带最为明亮，故确定特异性引物EF-AF/AR的PCR反应的最佳循环数为37个循环。
　　2.4  巢式PCR的特异性检测
　　利用引物EF-688F/986R和特异性引物EF- AF/AR对靶标菌株及参考菌株进行巢式PCR检测（图4），仅有南洋楹溃疡病菌菌株BL1331和HD?1332（泳道1～2）扩增到单一目标条带（264 bp），而其他参考真菌菌株样本（泳道3～10）和空白对照（泳道11）均没有目的片段。
　　2.5  巢式PCR的灵敏性检测
　　利用引物EF-688F/986R和特异性引物EF-AF/AR对可可毛色二孢菌供试菌株BL1331进行巢式PCR灵敏性检测（图5），可可毛色二孢菌DNA浓度为1 ng/μL～1 fg/μL时均可稳定扩增出单一特异性条带（264 bp），而在DNA浓度为100 ag/μL时无目标条带产生，巢式PCR可检测到1 fg/μL的可可毛色二孢基因组DNA。
　　2.6  林间病样的巢式PCR检测
　　以林间随机抽选疑似病样的基因组DNA为模板进行巢式PCR检测。结果表明（图6），所有病样均可扩增出单一目的条带（泳道1～5：264 bp）。以菌株BL1331和HD1332基因组DNA为阳性对照的样本也能够扩增出单一明亮目的条带（泳道6和7），而以南洋楹健康组织样本DNA（泳道8）及水对照（泳道9）为阴性对照均未获得扩增条带，其说明该巢式PCR体系能够有效对林间南洋楹溃疡病菌进行检测。
　　3  讨论
　　可可毛色二孢菌主要分布在热带、亚热带地区，寄主十分广泛，为害木本植物可引起溃疡、枝枯、坏死、果腐等，造成经济损失[6-7]。国内外已报道的可可毛色二孢侵染引起的林木病害主要有：橡胶速衰病、回枯病[8-9]，杧果流胶病、顶枯病[10-11]，毛葡萄穗轴褐腐病[12]，黄山栾树裂皮病[13]，腰果枝枯病[14]，肉桂枝枯病[15]等。近年来，本研究组经过长期的病害调查表明，溃疡病在广东省博罗、惠州等地的南洋楹种植区普遍发生，危害严重，通过形态及分子鉴定其病原是可可毛色二孢[5]，并研究了在不同的培养基、碳源、氮源、温度、pH及光照等条件下对该病原菌菌丝生长的影响[16]。国内外有关可可毛色二孢快速分子检测的研究鲜有报道。Xu等[17]基于ITS序列，针对蓝莓冠腐病的3种病原菌L. theobromae，Neofusicoccum parvum及Botryosphaeria dothidea分别设计引物Lt347-F/R，Np304-FIR及FaF/Bt2b，能够特异性地区分3种蓝莓冠腐病菌，其中针对L. theobromae的特异性引物Lt347-F/R的检测灵敏限度是1 ng。高灵敏度是病原菌快速分子检测的重要指标。巢式PCR技术由内外2对引物先后对靶序列进行扩增，使其DNA拷贝数以指数增加，灵敏度显著提高。陈杰等[18]依据核桃枝枯病菌小新壳梭孢（N. parvum）的几丁质合酶基因（CHS1）设计了特异性引物CT-WK3-S/CT-WK3- A和CT-N-S/CT-N-A，建立的巢式PCR对N. parvum的检测灵敏度可达30 fg/μL，比常规PCR提高了10倍。王健生等[19]利用靶标序列CYP51C建立的巢式PCR可检测到1 pg的大豆枯萎病菌尖镰孢菌（Fusarium oxysporum）的基因组DNA。翻译延伸因子（EF）在tRNA转运核糖体中发挥作用，是编码蛋白质的单拷贝核基因，具有高度的保守性和较丰富的种间变异，也是研究系统发育的重要分子标记[20]。本研究利用EF 1-α编码基因通用引物EF-688F/986R和特异性引物EF- AF/AR组合建立的巢式PCR灵敏性高，对南洋楹溃疡病菌L. theobromae的检测限度为1 fg/?L。研究结果也表明，如仅用特异性引物EF-AF/AR对南洋楹溃疡病菌进行常规PCR扩增，检测限度为10 pg/μL（未报道）。本研究建立的巢式PCR与常规PCR相比较，灵敏度提高了104倍。 Zhao等[21]报道从南洋楹、相思、桉树、林生杧果及泡桐等病样中经过常规组织分离能够获得假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）菌株，假可可毛色二孢与可可毛色二孢的种间形态差异小，序列比对差异小[22]。本研究基于EF 1-α建立的巢式PCR具有高度特异性，仅靶标菌南洋楹溃疡病菌可可毛色二孢获得了单一目的条带，而同属不同种的假可可毛色二孢菌及其他参考真菌均无扩增条带。本研究建立的南洋楹溃疡病菌的巢式PCR检测快速、准确和灵敏性高，对南洋楹病害的早期防控及监测具有一定的实践意义。
　　致  谢  广西农业科学院植保所莫贱友研究员和青岛农业大学植物医学学院梁晨教授提供部分菌株，特此致以衷心的感谢！ 　　参考文献
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