番茄筋腐病抗感材料果实中CAD基因的表达与分析
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摘要：以筋腐病易感高代自交系C285和抗病高代自交系P31的果实为材料，研究了番茄果实不同发育时期木質素含量的差异、果实中CAD基因的预测及2个CAD基因的相对表达。结果表明，C285果实中木质素含量在转色期时达到峰值，红熟期略有降低，而P31果实中的木质素含量在绿熟期、转色期及红熟期变化较小，绿熟期含量最低、红熟期最高;利用拟南芥CAD基因作为参考基因，在番茄中共查询到5个CAD旁系同源基因，且在核酸水平与拟南芥中同源基因间的一致性为66.7%;5个CAD基因在2份材料中存在13个突变位点，其中Solyc01g107590（CAD590）和Solyc03g078440（CAD440）突变位点较多;CAD590和CAD440在P31的绿熟期和转色期相对表达量较为稳定，在红熟期则大幅升高，而2个基因在C285中则均呈下降趋势，其中CAD440降幅更大;绿熟期CAD590和CAD440在C285中相对表达量与P31相比分别高出2倍和5倍，转色期P31中CAD590和CAD440则分别高于C285同期的表达量，其增幅分别为44.4%、130%、170%;而红熟期2个基因的相对表达量在P31材料中差异较小。因此推断CAD基因的表达与木质素含量之间存在一定关系。
关键词：番茄;筋腐病;木质素;肉桂醇脱氢酶（CAD）;基因表达与分析
中图分类号： S436.412.1+9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）23-0081-04
随着人们对于番茄需求量的增加，番茄的栽培面积在不断扩大，尤其是设施栽培面积逐年增加，但病害也层出不穷，近年来，番茄筋腐病成为严重制约番茄生产的一类生理性病害，影响番茄果实的商品价值，成为迫切需要解决的问题。番茄筋腐病，也称条腐病，一般发生在冬、春季的设施保护地与露地，主要危害果实，但叶片和茎在外观上并无明显变化。1921年，这种病害被首次提及，随后在世界上广为报道。Bewley等得出番茄筋腐病产生的重要因素是缺钾[1]。但同时有研究表明仅多施钾肥不能彻底解决问题。1958年，日本的农学家首次在该国发现番茄筋腐病，随后发现致病的其中一个关键原因是保护地长期连作。该病在果实上表现出褐变型筋腐果与白变型筋腐果2种类型。研究发现引起番茄筋腐病发生的因素包括番茄品种、温度、光照时间、光照度、CO2含量、土壤理化性质、施肥种类等。
木质素（lignin），是酚类多聚体，植物体内的大分子物质，由肉桂醇单体集聚而成，有运输水分与矿物质、增强机械强度及抵御不良环境的作用。木质素的生物合成途径由2步组成：在细胞质中，通过一系列酶催化，苯丙氨酸或酪氨酸逐步转化为木质素单体，然后被转运到细胞壁通过脱氢聚合成木质素[2]。肉桂醇脱氢酶（cinamyl alcohol dehydrogenase，简称CAD）是木质素合成途径中最早研究的酶类之一，主要在木质素单体合成过程中的最后一步起作用[3-4]。CAD基因存在同源基因，拟南芥中CAD类似基因有17个，9个基因（AtCAD1～AtCAD9）与烟草和火炬松存在70%相似，为真正CAD基因，余下8个基因（AtCAD101～AtCAD108）为相似基因[5]。大多数植物中，CAD底物类似物被抑制活性后，植物抗病能力减弱，易感染病原菌。
目前，CAD对木质素的合成、调控已取得较好成效，主要在杨树、水稻、小麦中的改良品种、抗病方面的研究，但CAD基因的表达与分析对番茄筋腐病所产生的影响以及如何指导番茄育种的报道还非常少。因此本试验以番茄筋腐病易感高代自交系C285和抗病高代自交系P31为试验材料，通过对木质素代谢关键基因CAD的分析，研究番茄筋腐病果实与正常果实在相对基因表达量上的差异分析;研究抗感番茄筋腐病果实在绿熟、转色及红熟期果实中基因CAD的表达，探讨番茄筋腐病发生过程中木质素生物合成与哪些基因的异常表达有关，从而揭示筋腐病发生的分子机制，达到从分子角度进行预防的目的。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用的2份番茄材料为青岛农业大学大学园艺学院番茄课题组提供的筋腐病易感高代自交系C285和抗病高代自交系P31。
1.2 试验方法
1.2.1 木质素含量测定方法 本试验中通过木质素（lignin）含量试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定木质素含量。
1.2.2 CAD基因的预测及突变位点分析 参考拟南芥CAD基因家族的9个基因，从番茄的基因组中去找同源基因。系统进化树采用Mega 4.0的NJ（neighbor joining）法。直系和旁系同源基因的一致性采用Needle程序（http：//emboss.sourceforge.net/）。突变位点分析主要依据P31和C285这2份材料的重测序数据。
1.2.3 荧光定量分析方法
1.2.3.1 植物总RNA的提取及cDNA的合成 本试验中通过EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（TaKaRa公司）进行。cDNA的合成采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒。
1.2.3.2 CAD基因引物设计 针对CAD基因在2份材料中的突变位点分析，筛选出2个突变位点较多的同源基因Solyc01g107590（CAD590）和Solyc03g078440（CAD440），采用Primer3软件进行引物设计，扩增片段长度设定在180～250 bp，引物长度为20 bp左右，退火温度为60 ℃，所设计的引物如表1所示。内参基因选用Actin，引物信息（F：5′-CAAACGAGAATTGCCTTGGT-3′，R：5′-CTTAACATCCGCACCAACCT-3′），扩增片段长度为233 bp，退火温度为60 ℃。 1.2.3.3 荧光定量PCR 以番茄果实cDNA为模板，荧光定量PCR仪选用Roche（Light Cycler 480）。反应体系（20.0 μL）：RNA的反转录反应液（cDNA溶液）1.6 μL，10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ，0.8 μ正向引物，0.8 μ反向引物，6.8 μL dH2O。反应程序：95 ℃ 30 s;PCR反应40循环（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）;熔解。试验设置3次重复，反应结束后分析荧光值变化曲线和熔解曲线。
1.2.3.4 数据处理与分析 采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量;采用Excel 2010和DPS 7.05进行数据处理分析及作图。
2 结果与分析
2.1 不同番茄果实发育过程中木质素含量的比较
由图1可知，番茄感病高代自交系C285果实中木质素含量在转色期时达到峰值，红熟期略有降低，而P31果实中的木质素含量在绿熟期、转色期及红熟期变化较小，绿熟期含量最低、红熟期最高。
2.2 番茄中CAD基因的预测
在番茄基因组（SL 3.0）及注释基因的基础上，针对拟南芥中CAD家族基因，采用BLASTN和BLASTP程序对番茄中木质素生物合成基因进行了鉴定。笔者在番茄中共搜索到5个同源基因，分布于番茄染色体1、3、11、12等4条染色体中，
番茄CAD基因与拟南芥相应基因间在蛋白质水平上保持 61.5%～73.0%的一致性，平均为66.7%（表2）。
拟南芥中CAD家族成员有9个基因，且功能均已通过验证，该家族基因也有串联重复基因簇出现（CAD6、CAD7和CAD8）。通过序列比对发现在番茄中存在5个同源基因，同时也有串联重复基因簇的出现（Solyc11g011330和Solyc11g011340）。系统进化分析发现（图2），2个串联重复基因簇聚在一个分支，这暗示CAD在拟南芥和番茄中可能经历了相似的进化途径。Solyc03g078440与CAD9、CAD2及CAD3聚为一簇且与2个串联重复基因簇亲缘关系较近;Solyc12g055820与CAD1聚在一起，两者可能为直系同源基因;Solyc01g107590则与CAD4和CAD5亲缘关系较近。
2.3 不同番茄材料中CAD基因的變异分析
2份材料重测序数据（表3）显示，5个CAD基因中有13个SNP（单核苷酸多态性）或InDel（插入缺失标记）位点，且绝大多数突变位点分布在基因间区或内含子区。Solyc01g107590和Solyc03g078440在2份材料中存在的变异位点较多，分别为4个和5个，突变位点多有可能在基因表达水平产生影响。
2.4 不同番茄果实中CAD基因的表达
2.4.1 不同番茄果实发育过程中CAD的表达与分析 在果实发育过程中2番茄CAD基因的相对表达量见图3，CAD590和CAD440在P31的绿熟期、转色期和红熟期相对表达量较为稳定;而2个基因的表达在C285中则均呈下降趋势，其中CAD440降幅更大。
2.4.2 不同番茄果实相同发育阶段CAD的表达与分析 木质素生物合成关键基因CAD在2份材料中的相对表达结果（图4）显示，绿熟期CAD590和CAD440在C285中相对表达量与P31相比分别高出约2倍和5倍;转色期P31中CAD590和CAD440则分别高于C285同期的表达量，其增幅分别为130%和170%;就红熟期而言， 2个基因的相对表达量在P31
材料中差异较小。
3 讨论与结论
本研究以拟南芥中CAD基因家族的9个基因作为参考基因，在番茄中共查询到5个CAD旁系同源基因，且在核酸水平与拟南芥中同源基因间的一致性为66.7%;5个CAD基因在2份材料中有13个存在突变位点，其中Solyc01g107590和Solyc03g078440在2份材料中存在的变异位点较多。番茄抗病材料P31和感病材料C285的果实中木质素含量在不同生育阶段均有差异，感病材料C285中木质素含量在转色期时达到峰值，红熟期略有降低;抗病材料P31中的木质素含量在3个时期变化较小，绿熟期含量最低、红熟期最高。说明抗病材料P31在番茄生长过程中，CAD基因表达正常，木质素含量相对稳定，而感病材料C285在每个时期其木质素含量不如抗病材料P31稳定，CAD基因存在变异所致，这与已有研究结果[8-9]一致。
本研究结果表明，CAD590和CAD440在P31的绿熟期和转色期相对表达量较为稳定，在红熟期则大幅升高;而2个基因的表达在C285中则均呈下降趋势，其中CAD440降幅更大。绿熟期CAD590和CAD440在感病材料C285中相对表达量与P31相比分别高出2倍和5倍，转色期也分别提高了130%和170%，而红熟期2个基因的相对表达量在2份材料中差别较小。同一基因在不同材料中同一时期表达不同，不同基因在同一材料同一时期也不尽相同，这与朱金鑫等的研究结果[10-11]一致。
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收稿日期：2017-10-27
基金项目：山东省自然科学基金（编号：ZR2014CQ034）;山东省现代农业产业技术体系建设专项（编号：SDAIT-05-02）;青岛农业大学高层次人才科研基金（编号：663-1115041）;山东省农业良种工程。
作者简介：李 芬（1993—），女，山东菏泽人，硕士研究生，研究方向为蔬菜遗传育种与分子生物学。E-mail：15192642252@163.com。
通信作者：王 富，博士，教授，研究方向为番茄遗传育种及生物技术。E-mail：wangfuabcd@163.com。
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