大白菜黑腐病研究进展

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　　摘    要：近年来，大白菜黑腐病日益加重。笔者综述了大白菜黑腐病的病害症状、黑腐病病原菌的特征特性、黑腐病病原菌对抗氧化系统的影响、黑腐病蛋白质组学研究等进展。如黑腐病菌侵染植物后活性氧的生成速率增加、抗氧化酶活性也发生改变;蛋白质组学研究表明，防御和胁迫、及光合系统相关的蛋白丰度增加，茉莉酸和乙烯途径被激活。
　　关键词： 大白菜; 黑腐病; 特征特性; 抗病性鉴定
　　Research progress on black rot in Chinese cabbage
　　MENG Xuejiao1，2， SHI Qingxin2， CHEN Lixin 2
　　（1. Postdoctoral Programme， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086， Heilongjiang， China; 2. Horticultural Sub-academy， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069， Heilongjiang， China）
　　Abstract： In recent years， black rot in Chinese cabbage has become increasingly serious. This paper reviews the research progress of black rot disease symptoms in Chinese cabbage， the characteristics of its pathogen， the effects of its pathogen on the antioxidant system， proteomics study of this disease， etc.. Such as infection of its pathogen lead to increase of the rate of reactive oxygen species production， and changes of the activity of antioxidant enzymes. Proteomics studies show that the abundance of defense and stress， and photosynthetic system-related proteins increased， jasmonic acid and ethylene pathways are activated.
　　Key words： Chinese cabbage; Black rot; Characteristics; Identification of disease resistance
　　全國白菜种植面积从1996年的60万hm2扩大到2014年的260万hm2，占全国蔬菜总面积的13%;总产量11 000万t，占全国蔬菜总产量的15.5%。十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种[Xanthomonas campestris pv. campestris （Pam.） Dowson]引起的世界性重要病害之一[1]。黑腐病寄主范围相当广泛，主要危害甘蓝、结球白菜、不结球白菜、萝卜、油菜、花椰菜、青花菜、绿菜花等[2-12]。由于气候条件变化、多茬栽培、国外春大白菜品种的引进和黑腐病病原菌分化等，黑腐病对蔬菜生产的威胁日益加重。20世纪80年代，黑腐病在全国各地已经普遍流行，北起黑龙江、南至海南岛均有分布，使大白菜产量和品质遭受很大损失[13-15]，并且感染了十字花科以外的蔬菜[16]。
　　1 大白菜黑腐病病害症状
　　十字花科蔬菜黑腐病主要发生在秋季，早播、多雨时节和重茬地块发病严重[17]。十字花科黑腐病菌通过排水器、气孔、根、或创伤口侵染十字花科植物，主要危害叶片、叶球和球茎[18-19]。大白菜幼苗期即可发病，但以成株发病为主。
　　大白菜幼苗期发生黑腐病时，真叶的叶脉上出现小黑斑或细黑条，根髓部变黑;成株期时，细菌从叶缘的水孔侵入，之后形成三角形褪绿黄斑，叶缘产生黄褐色坏死斑，再沿叶脉蔓延，逐渐扩大成“V”字形或长条形黄褐斑，边周伴有黄色褪绿晕带，该叶脉变黑坏死[20]。
　　2 黑腐病菌特征特性研究
　　野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv. Campestri）（Xcc）为短杆菌，革兰氏染色阴性，细胞大小为（0.4～0.5） μm×（0.7～3.0） μm，有荚膜，无芽孢，极生鞭毛，菌体单生或链生。在牛肉膏琼脂培养基上近圆形，初期呈淡黄色，后期变蜡黄色，形成黏稠状菌落。黑腐病菌生长最适温度为25～30 ℃，最低5 ℃，最高39 ℃，致死温度为51 ℃，最适湿度为80%～100%[21]，在干燥环境下仍可存活12个月[22]。
　　研究发现黑腐病病原菌的生理小种分化十分复杂。有关1、4、6号生理小种的报道是最多的。解永梅等[23]分别在细胞和分子水平上完成了山东省地区的黑腐病病原菌鉴定，进行致病性测定后获得4株强致病力的菌株，结果发现，这些病原菌的生物学特性基本一致，可以确定为同一种病原菌，并鉴定为Xanthomonas campestris pv.campestris，并确定此病原菌就是引起山东省大白菜黑腐病的致病菌。芦燕等[24]对采自陕西省不同地区的35个大白菜黑腐病病原菌菌株的致病类型进行了划分，用7个不同抗性大白菜品种作为鉴别寄主，根据植物的抗病性反应将这35个大白菜黑腐病菌株划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 6类致病型，其中，Ⅲ型致病力最强，Ⅱ型为典型致病型。 　　其他研究，如侵染拟南芥的3个菌株CN14，CN15和CN16的基因组序列被检测，获得了不可预期的结果，在日后分析比较方面具有重要作用[25]。
　　3 抗病性鉴定
　　近年来，我国对大白菜黑腐病的研究报道不多。在抗病育种过程中，进行抗病性鉴定来筛选抗病品种是必不可少的。因温度、湿度等试验条件相对较易控制，且节约空间，所以，抗病性鉴定工作主要在室内进行。
　　翟文慧等[26]进行了大白菜黑腐病鉴定的湿度试验，及其苗期与成株期抗病性的相关分析研究，研究发现大白菜苗期与成株期抗病性呈显著线性关系，说明用苗期人工接种鉴定大白菜黑腐病抗性的方法可行且可靠，可以缩短研究时间。
　　芦燕和张鲁刚[27]以陕西省大白菜主产区致病力强的黑腐病菌株YL-17做菌源，以4个不同抗病性的大白菜品种为试材，研究了苗龄、接种浓度和发病温度对抗病性鉴定的影响，建立了优化的大白菜黑腐病苗期人工接种鉴定方法，该方法鉴定结果准确可靠。即接种方法采用喷雾法，接种菌量为1.0×108 pfu·mL-1，接种时期为4～5叶期，发病温度控制在26 ℃。解永梅[20，23]对山东省大白菜黑腐病的研究，完善了黑腐病抗病性鉴定方法研究，证明了黑腐病菌存在致病型分化，并进行了抗性资源的筛选等。
　　4 黑腐病菌对抗氧化系统和植物细胞结构的影响
　　植物感染病原菌后，体内活性氧生成速率、防御酶的活性发生改变，并发现这些变化与植物的抗病性相关。
　　解永梅等[20]对不同抗性白菜品种接种黑腐病菌，接种后发现，抗病品种多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性高于感病品种，且PPO活性的变化与品种抗病性表现呈正相关。多酚氧化酶（PPO）可催化酚类物质氧化成醌，具有很强的毒性，能杀死病原菌，推测抗病品种抗黑腐病可能与PPO活性升高有关。苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）是植物次生物质代谢系统中关键的一个酶，解永梅等[20]的研究还发现PAL与PPO的表现相同，即抗性强的品种中 PAL的活性要高于抗性弱的品种，激活次生代谢。
　　蔚丽珍等[28-29]对黑腐病菌侵染不同抗性大白菜幼苗后叶片抗氧化系统的反应也进行了研究，发现在接种黑腐病菌36 h后超氧阴离子产生速率直线上升，且抗性品种的增加更为明显，丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）作為膜脂过氧化的标志，其含量均上升，但总体上来说抗病品种的MDA含量明显低于感病品种，表明 MDA含量与抗病性呈负相关。总体上，抗病品种和感病品种接种黑腐病菌后超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性均高于对照，这与解永梅[20]之前的研究结果一致，阻止了体内活性氧的过量积累，SOD活性与抗病性呈正相关。过氧化物酶（peroxidase，POD）活性升高，与解永梅[20]的研究结果一致，且发现与不同的发病阶段相一致，与抗病性呈负相关。过氧化氢酶（catalase，CAT）活性则二者变化不一致，抗性材料表现为升-降-升，感性材料表现为先降后升。而解永梅[20]的研究发现接种黑腐病菌后，不同抗性品种的CAT活性均急剧下降，之后感病品种呈现持续下降的趋势，而抗病强的品种在下降之后呈现上升趋势达到最高峰后又逐渐下降。
　　其他十字花科蔬菜也有相关研究，如通过比较不同抗病类型的青花菜接种黑腐病菌后防御酶活性的变化，发现抗病材料具有较高的POD、PPO、PAL活性，而感病材料的SOD活性较高[30]。接种后抗病材料的SOD、POD、PAL、PPO和CAT活性均高于对照，且活性变化率高于感病材料[30]，与他人相关研究结果一致，“抗病”品种比“感病”品种保持了较高的酶活性[31];甘蓝黑腐病的研究发现，接种病原菌后，6个品种叶片中SOD、POD、PAL和PPO等4种酶活性均升高，且品种间差别较大[32]。
　　不同抗性材料接种黑腐病菌后发现，抗病材料细胞内膜结构和细胞器受损伤程度较轻且较晚，并伴随细胞壁加厚和膜结构小泡数量增多的现象，且细胞壁周围有致密聚集物出现;而感病材料受损严重且较早，细胞出现严重的质壁分离现象，细胞器膨胀变形，功能丧失，最后整个细胞解体死亡[30，33]。
　　5 转录组与蛋白质组学研究
　　黑腐病菌转录组的研究发现，prc基因，即XCC致病机制相关的特殊蛋白酶发生转位子突变，引起毒性及胞外蛋白质产量降低，RNA-Seq发现91个差异表达基因，这些基因主要参与碳水化合物转运和代谢、细胞壁/细胞膜生成、翻译后修饰、蛋白周转和分子伴侣、无机离子转运和代谢、及信号转导机制[34]。
　　蛋白质组学技术的不断发展和完善，为深入分析植物应答生物及非生物胁迫的代谢和调控机制提供了高通量的技术平台，利用此平台中的双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）技术、凝胶染色技术、同位素标记相对和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）、以及生物质谱技术等能够系统地分析植物体细胞、亚细胞结构、组织和器官应答胁迫的蛋白质组变化。
　　关于野油菜黄单胞菌野油菜致病变种与寄主甘蓝（Brassica oleracea）表达的最新蛋白质组学研究，即Santos等[35]运用label-free shotgun 2D-nanoUPLC/MSE分析XCC与易感植物（Kenzan-REK）、抗性植物（Uni?ao-REU）共生及培养基（对照）中情况，并运用qPCR方法确定被选择的一些基因的差异表达情况，该篇文章主要研究病菌的致病性机制。一些野油菜黄单胞菌株的完整基因组序列已知，可以编码4 000多个蛋白质。发现在病原菌侵染48 h后Xcc 细胞数量最多，之前该研究团队也运用双向电泳技术研究XCC与甘蓝互作，但是只鉴定了少量蛋白。大部分报道都是研究细菌在培养基中培养，很少研究黄胞杆菌属蛋白积累在植物提取物中。通过比较抗性植物（REU）及对照，发现121个差异蛋白质，鉴定到108个差异蛋白质，其中80个是对照特有的，在抗性植物中14个蛋白质上调，14个蛋白质下调。易感植物与对照的比较中，发现127个差异蛋白质，鉴定到105个差异蛋白质，其中46个是对照特有的，在易感植物中34个蛋白质上调，22个蛋白质下调，大部分差异蛋白表达丰度是增加的，主要参与细胞代谢（如柠檬酸循环、糖酵解、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、及其他碳水化合物代谢），15%参与蛋白质合成（如转录和翻译因子，及核糖体蛋白）。抗性植物与易感植物进行比较，发现17个差异表达蛋白，易感植物中有4个蛋白质上调，13个蛋白质下调，且有5个蛋白是易感植物特有的。在植物中，鉴定到参与乙烯感应和诱导茉莉酸的蛋白质，说明甘蓝与病原体互作过程中茉莉酸和乙烯途径被激活。特别的是，一些防御和胁迫相关蛋白在抗性植物中被鉴定到，如脂氧合酶、膜联蛋白等，还有光合系统相关的蛋白，这些都说明植物通过增加调节光合作用的重要蛋白质来减少黑腐病菌带来的损伤[35]。 　　6 展 望
　　大白菜因其纖维素含量丰富，受广大消费者的喜爱，种植面积较大，尤其是东北地区，因受传统习俗影响，人们还有贮藏秋菜和腌制酸菜的习惯。另一方面，近年来，随着白菜加工业不断壮大，对白菜的需求量一直较大。田间调查发现，黑龙江省大白菜的黑腐病日益加重，为了保证市民的菜篮子工程，急需加大力度对其进行研究，通过分子生物学、蛋白质组学等技术加强黑腐病菌致病机制的研究，急需培育满足产业及市场需求的新一代优质多抗新品种。这不仅是科研工作者的任务，也是社会的需求。
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