稻曲病侵染规律研究进展与展望

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　　摘要：水稻稻曲病（Rice false smut，RFS）发生情况日趋严重，已经上升为水稻主要病害之一。目前对稻曲病的研究已经取得一定的进展，但对其病菌侵染方式和侵染机理的了解还有局限性。通过激光共聚焦和透射电镜等方法已经基本明确了稻曲病菌在颖花内的侵染过程，然而稻曲病是否具有系统侵染、种子带菌以及幼苗根部侵染对病害发生的影响程度仍有待明确。对稻曲病菌研究中存在的亟待解决的问题进行了探讨分析，同时也对稻曲病主要的防控手段和病原监测方法进行了总结。
　　关键词：稻曲病（Rice false smut，RFS）;侵染方式;侵染机制;活体寄生
　　中图分类号：S432.1         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）09-0005-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.001           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract： Rice false smut has become one of the most severe rice disease in China. At present， some progress has been made in the study of rice false smut. There are still some puzzles about infection site and infection mechanism in Villosiclava virens. Laser confocal microscopy and transmission electron microscopy （TEM） have helped to provide the specific description of infection process of rice false smut in spikelet. However， there were no molecular evidence about the contribution of systemic infection， seedling and seed infection in life cycle. The problems existing in the research of rice false smut were discussed and analyzed. At the same time， the main methods of prevention and control of rice false smut and the methods of pathogen surveillance were summarized.
　　Key words： rice false smut; infection site; infection mechanism; biotrophic infection
　　水稻稻曲病（Rice false smut，RFS）是由子囊菌门稻曲病菌（Villosiclava virens）引起的[1]，其无性世代为Ustilaginoidea virens。近年来稻曲病流行情况日趋严重，与稻瘟病、纹枯病并称水稻新三大病害，据统计中国有1/3的水稻产区都受到稻曲病的危害[2]。
　　稻曲病菌在破口前侵染水稻穗部，而后通过吸收水稻颖壳内的营养快速生长最终膨大形成稻曲球，成熟的稻曲球由内部质密的菌丝和外部覆盖大量墨绿色厚垣孢子组成。特定条件下，稻曲球上可形成菌核。据统计在温带和亚热带地区携带菌核的稻曲球比例大约在2.1%～15.0%，菌核形成大都在10月至11月初[3]。厚垣孢子在田间能够存活超过4个月，而菌核则能够存活时间更久，成熟的菌核需要2～5月的休眠期才能分化形成子实体[3]，子实体成熟后释放子囊孢子，厚垣孢子及子囊孢子都能够成为第二年的初侵染源。此外，稻曲球中富含稻曲菌素（ustiloxins）和稻核黑粉菌素（ustilaginoidins）两类真菌毒素[4，5]。稻曲病的流行发生不仅会对稻米的产量和品质造成严重影响，而且其产生的稻曲病菌毒素对人和生畜都有毒性。
　　化学防治是稻曲病防控的主要手段。研究表明穗苞破口前4～15 d是药剂防治的主要时期，其中前4～7 d防治效果最佳[6]。播种前种子处理也可以有效控制稻曲病。有报道不同的水稻品种对稻曲病的抗感水平存在差异[7，8];Han等[9]通过RNA-Seq比较了抗病品种IR28和感病品种LVP9在病菌侵染初期基因表达动态的差异。然而目前仍然没有主效抗病基因被鉴定，数量性状位点（QTLs）的报道也比较少[10，11]。稻曲病抗病机理研究仍处于起步阶段，抗病种质资源仍然缺乏。
　　近年来稻曲病发病情况日趋严重，研究热度也在增加。但由于稻曲病菌生物学性状特殊，导致研究存在一定的困难，所以进展也相对较缓慢。本文从稻曲病病害侵染规律角度对稻曲病相关研究进行总结和展望。
　　1  稻曲病病源种群鉴定与监测
　　田间稻曲病菌种群的监测有利于病害发生的预测预报。有学者通过基因组DNA指纹图谱技术对稻曲病菌种群进行分析，发现群体分布与地理区域之间关系显著， 推测其传播流行具有区域性[12]。Wang等[13]对来自湖北省的153个菌株分析，证实了地区对种群的影响多于水稻品种的影响。以上種群分布的研究结果为稻曲病区域防控提供了理论基础。菌株分离有两种主要方法，分别是厚垣孢子悬液法和组织块分离法[14]。采用厚垣孢子分离方法，鲜黄色稻曲球平均分离成功率超过90%，墨绿色的厚垣孢子则无法成功分离[15]。此时的厚垣孢子已经进入休眠状态，日常状态下不易萌发，所以对于厚垣孢子已进入休眠或者稻曲球保存时间较久的情况，火焰灼烧组织分离法更有效。经过验证使用75%乙醇浸润后再用火焰灼烧，最后使用升汞消毒40 s分离效果最好[14]。虽然稻曲病菌是活体营养型，但其也能够在培养基上生长，属非专性寄生。在以蔗糖为糖源的培养基中生长最好，并且蔗糖含量为2%～3%最佳。缺乏氮素的条件下不能生长，氮、钾、锌缺乏则生长情况较差。放置在黑暗条件下生长状况较好，菌丝生长温度为10～30 ℃，最适生长温度为28 ℃[16]。 　　除了使用传统的分离鉴定方法对菌源进行监测外，新型的分子生物学手段具有灵敏度高、检测周期短等优点。Zhou等[11]通过比较多个不同菌株之间的ITS1、ITS2和5.8s rRNA序列設计了能够检测稻曲病菌的特异引物。Chen等[17]利用稻曲病菌5.8S核糖体DNA设计的特异引物检测了24个水稻样本，其中9个样品呈阳性，污染率达37.5%。为了检测土壤中微量的稻曲病菌样本，有学者根据核糖体DNA开发基于Real-time PCR技术的特异引物。通过检测比较发现Real-time PCR检测灵敏度比传统PCR和巢氏PCR高100倍以上[18]。但是基于PCR检测方法均需要相关试验设备，操作步骤相对复杂，反应时间较长。Yang等[19]开发了一种基于环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的快速检测技术，这种方法具有反应时间短、操作简便、特异性强和灵敏度高的特点。对于田间种子检测只需要用无菌水浸透种子，将浸出液体取10 μL加入到含有反应试剂的离心管中，将离心管放置到65 ℃恒温水浴锅1 h，80 ℃加热10 min即可终止反应。此时即可通过HNB或者SYBR green I染料的颜色变化观察反应结果。这种方法为田间实地监测提供了便利，降低了病原菌检测的成本。
　　对于病原菌致病力的测定，因为侵染位点和侵染方式的特殊性，稻曲病采用水稻穗部注射的方法接种。在20世纪接种技术研究的早期，外国学者最先采用的方法是厚垣孢子喷雾接种。杜毅等[20]首次报道使用分生孢子注射接种水稻穗苞的方法，经过不断改进该接种方法已经可以达到穗发病率100%。抽穗破口前6～9 d，16：00～18：00时段，注射由PS培养基配制的分生孢子菌丝混合液，分生孢子浓度达到108效果最佳[21，22]。
　　2  稻曲病菌的侵染方式
　　目前对稻曲病菌的侵染方式有两种主要观点。因为稻曲穗部发病是惟一可见病征，并且人工接种时穗部注射接种的方式发病率明显高于根部接种，所以主流观点倾向于认为稻曲病菌子囊孢子和厚垣孢子由上部随水流进入孕穗期水稻颖壳内部完成侵染。Ashizawa等[23]使用GFP荧光菌株对侵染位点进行观察，提出病原菌是从颍壳顶端外稃和內稃之间的缝隙进入。Tang等[24]认为菌丝进入颍壳内后首先侵染上部的花丝、花药和柱头，然后菌丝将雄蕊和雌蕊完全覆盖直至颍壳内充满了菌丝。Song等[25]使用激光共聚焦对绿色荧光标记菌株在颍壳内扩展各个时期做了观察并进行了详细的描述。
　　稻曲病菌菌源空气传播的可能性较大。伏荣桃等[26]对不同气象条件下稻曲病菌孢子释放量进行了监测。发现高温高湿的气候条件利于孢子释放，夏季天气炎热阴雨较多年份发病率也相应更高，推测空气中悬浮的孢子量与发病率直接相关。俞咪娜等[27]对来自同一穗不同稻曲球，同一个稻曲球的不同部位分别进行了分离，意外的是来自同一个稻曲球的菌株致病力也存在分化现象。经过REP-PCR分子指纹图谱（Repetitive DNA PCR-based genomic fingerprinting）遗传多样性分析，发现它们被划分为不同的群体，由此推测一个稻曲球也可能混合不同来源菌株，穗部有可能同时接触不同的初侵染菌株。以上结果说明稻曲病通过空气传播，侧面说明穗部局部侵染的可能性较大。
　　另外一种观点认为稻曲病菌由水稻根部侵入，自下而上完成系统性侵染。张舒等[28]发现田间水稻套袋以后仍然可以发病，并且室内试验中只在种子和幼苗根部接种的植株后期均可以发病。刘见平等[29]研究发现土壤和种子消毒的处理发病率显著降低，说明种子带菌和土壤中越冬的病菌为主要初侵染源。陈永坚等[30]研究也发现带有厚垣孢子的种子当年发病率更高。吕博等[31]使用厚垣孢子分别在水稻芽期和三叶期进行接种，此后水稻各个时期茎叶和穗部使用特异PCR检测均有阳性。郑大伟等[32]使用激光共聚焦显微镜对苗期侵染进行观察，稻曲病菌能够在细胞间隙内扩展。以上结果表明幼苗根部系统侵染存在可能，但目前无论是穗部局部侵染还是从根部系统性侵染都没确凿的证据，是单一侵染还是两种侵染方式并存仍有待明确。
　　3  稻曲病菌的侵染机制
　　稻曲病是局部侵染还是系统侵染仍然没有确凿的证据，但水稻穗部颖花是主要侵染位点已经明确，所以颖花内的侵染模式也是稻曲病研究的重点。早期学者曾认为稻曲病菌只侵染已经受精的颖壳[33];后续的研究发现，虽然激活了灌浆相关基因的表达，但是被侵染的颍壳不能完成灌浆并形成子粒，而且子房受精的颖花内也无法形成稻曲球[34]。Tang等[35]将稻曲球解剖后显微观察发现其内部包裹的子房还是鲜活的。Song等[25]对花柱透射电镜照片，发现菌丝侵入到花柱表皮细胞和柱头细胞的缝隙当中，并且扩展到细胞间质，但没有穿透寄主细胞。花粉的成熟受到了抑制，模拟了子房受精，病菌挟持了灌浆基因，为菌丝的生长提供营养。
　　稻曲病菌是比较典型的活体营养型病原菌，但与稻瘟病等其他菌株不同，没有明显的坏死斑出现，为了探究它如何克服寄主免疫防卫反应，Yin等[36]分析了bZIP转录因子家族基因，数据表明28个基因中有17个在侵染阶段表达上调，说明基因表达动态变化剧烈。对早期侵染阶段的转录组分析也发现分泌蛋白、次级代谢以及病原寄主互作相关基因高度富集[37]。Fang等[38]利用烟草瞬时表达系统对119个假定效应蛋白进行筛选，其中有13个能够引起坏死斑。通过酵母验证了其中11个具有分泌活性，并利用水稻原生质体确定了其致死活性。Zhang等[37]也对基因组中具有分泌活性的假定效应蛋白进行了分析，并且利用烟草瞬时表达系统鉴定了18个能够抑制坏死的效应因子。能够抑制坏死的效应因子在稻曲病侵染过程中的作用无疑是非常重要的。但是相比稻瘟病、小麦白粉病和大豆疫霉在病原植物互作方面深入系统的研究，稻曲病菌目前还没有病原植物直接互作的分子证据，也没有找到与效应蛋白互作的抗性蛋白和代谢通路。 　　除对效应蛋白探索分析外，功能基因组研究是挖掘致病关键基因的高效方法。目前稻曲病菌基因组分析已经取得初步进展。Zhang等[37]使用Illumina和454平臺对UV-8b菌株进行了深度测序并成功拼接，基因组大小为39.4 Mb;预测得到8 426个基因;与来自10个子囊真菌和一个担子菌基因组中的保守基因系统发育，分析发现稻曲病菌与两个昆虫病原真菌绿僵菌（Metarhizium spp）距离更近，甚至比侵染模式相似的麦角菌（Claviceps purpurea）更具亲缘性[17]。在此基础上稻曲病菌功能基因组的研究正在展开。Zheng等[39]首次报道对UvHog1基因成功敲除，发现敲除转化子表现出菌丝、分生孢子的生长缺陷，并且对SDS、刚果红和高渗环境敏感。Lv等[40]通过T-DNA插入体库的方法筛选到与菌丝生长、分生孢子形成、非生物胁迫以及致病相关蛋白UvPro1并且通过敲除对其进行了验证。Liang等[41]首次报道在稻曲病菌中使用CRISPR-Cas9系统对基因进行敲除，效率比传统敲除体系高200倍。
　　4  问题与展望
　　由于气候变化和栽培方式的改变，稻曲病流行情况日趋严重[42]。目前人类对稻曲病的了解仍然有限，以下方面仍然需要加强研究。
　　1）确定稻曲病初侵染来源及其侵染位点。利用携带分子标记的菌株接种对根部或苗期侵染发展动态进行监测。如何避免侵染过程中分子标记丢失，并且排除植物表面粘附孢子带来的干扰是技术难点。
　　2）稻曲病菌活体营养机制尚需探究。从技术角度来说，在稻瘟病、白粉病和大豆疫霉中，效应蛋白与寄主互作的研究方法已经非常成熟;然而稻曲病菌与寄主互作模式可能存在独特性，并且对水稻花器官组织侵染位点染色显微观察也存在困难。
　　3）目前通过图位克隆的方法仍然没有发现稻曲病的主效抗病基因，推测其抗病主要来源于数量性状位点，而水稻穗部物理性状差异对稻曲病致病力的影响也有待研究。
　　4）由于稻曲病侵染隐蔽、发病时段在水稻生产后期，所以对病害发生的预测预报技术开发非常急迫。在侵染前期使用LAMP等快速检测方法评估菌源数量，采取对应的控制手段可以有效减少稻米生产损失。
　　5）稻曲球表面菌素会危害人畜健康安全，其上的厚垣孢子和子囊孢子都可以成为次年的初侵染源。但迄今为止，关于稻曲球形成机制相关研究较少，稻曲球发育相关基因及代谢通路的研究未来能够帮助人类找到减少其形成的方法。
　　总的来说，稻曲病在水稻生长中的危害日趋严重，然而其侵染方式和侵染机制仍不明确，水稻抗病基因发掘和抗性品种的开发仍在进行。加强对稻曲病侵染规律和致病机理的研究，有利于在生产中对稻曲病进行全面防控。
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　　收稿日期：2018-12-26
　　基金项目：国家重点研发计划项目（2016YFD0200807）;湖北省技术创新专项重大项目（2017ABA146）;湖北省农业科技创新中心项目（2016-620-000-001-017）
　　作者简介：王佐乾（1988-），男，山东青岛人，助理研究员，博士，主要从事水稻病害研究，（电话）18971622069（电子信箱）wangzuoqian@sina.com;通信作者，张  舒，研究员，（电子信箱）ricezs6410@163.com。
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