SSR分子标记鉴定两系杂交水稻“荃两优2118”的种子纯度

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　　摘要 采用SSR分子标记技术鉴定两系杂交水稻“荃两优2118”的种子纯度。从48对SSR引物中筛选到2组引物（RM7120、RM8277）。随机选取“荃两优2118”种子6组，每组样品随机取192棵种子苗种进行纯度检测，结果显示同一样品SSR标记与田间鉴定结果接近，最大、最小差异分别为2.05%和0.23%。因此，SSR标记技术适用于“荃两优2118”的种子纯度鉴定。
　　关键词 SSR分子标记;两系杂交水稻;种子纯度;田间鉴定
　　中图分类号 S 511文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）01-0042-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.012
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Detection of Seed Purity of Two line Hybird Rice “Quanliangyou 2118” by SSR Marker Technique
　　WANG Li guang， ZHANG Xiang， HUANG Guan liu et al
　　（Anhui Hua’an Seed Co.， Ltd.， Hefei， Anhui 230031）
　　Abstract The seed purity of two line hybird rice “Quan liangyou 2118” was identified using simple sequence repeat （SSR） molecular markers. Two pairs of primers （RM7120 and RM8277） were screened out from 48 pairs of SSR primers. A total of 2 pairs of primers were used to test the purity of 6 groups of the “Quan liangyou 2118”， with 192 seed seedings in each group. The SSR identification results were basically agreed with the field identification results， the difference of which ranged from 0.23%-2.05%. The research results indicated that SSR markers could be utilized to identify the purity of “Quan liangyou 2118”.
　　Key words Simple sequence repeat （SSR） molecular markers;Two line hybrid rice;Seed purity;Field identification
　　杂交水稻质量的核心指标是种子纯度，因此准确、快速、经济地检测杂交水稻种子的纯度是种子企业在生产加工销售中最关心的问题[1]。两系杂交水稻种子纯度检验的方法有很多，目前被种子企业广范运用的方法主要为田间种植鉴定和SSR分子标记鉴定。其中，田间鉴定是目前运用最广、最有效、最准确的检验方法，田间鉴定主要通过海南加代种植或正季种植，在抽穗前及齐穗后多次进行观察记载，比较各单株间的植物学特征，通过品种的农艺特征特性鉴别真实杂交种及杂株[2]。不同品种或品系间存在大量的DNA序列差异，其中微卫星序列广泛分布在每条染色体上，SSR分子标记鉴定种子的纯度正是利用这种DNA序列的差异达到检测的目的。此外，SSR标记具有成本低、数量丰富、结果稳定、试验周期短等特点，因而SSR分子标记检测技术被广泛应用于杂交种子的纯度鉴定[3]。
　　鉴于此，笔者利用SSR分子标记检测技术，对荃两优2118母本及父本进行多态性筛选，筛选出了2对特异性好的引物（RM7120、RM8277），并且这2对引物对荃两优2118的双亲均显示出很好的多态性，在荃两优2118上显示出共显性特征，因此适宜于对这2对引物进行纯度鉴定。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　试验材料两系杂交水稻“荃两优2118”及亲本样品由安徽华安种业有限责任公司提供。2108年入库的种子中，随机选取了6个批次的杂交种子，分别编号为18-1、18-2、18-3、18-4、18-5、18-6。在光照培育箱中培育7 d，取合適的幼苗进行后续的试验。试验所用的Tag酶为TaKaRa的高保真酶，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 DNA模板的制备。①亲本DNA的提取。分别取父本与母本的种子苗嫩叶0.2 g左右，分别装入2.0 mL离心管中。用液氮冷冻后磨碎，加入提取液，水浴，再加入三氯甲烷、异戊醇、乙醇等试剂，提取DNA。②杂交种子苗的DNA提取。首先，将上述已培育7 d左右的幼苗每个批次随机取192棵，每棵幼苗剪取1～2 cm左右的嫩叶，分别置于96孔PCR板中;其次，在PCR板孔中加入90 μL的1 mol/L NaOH溶液，确保将植物组织完全浸泡，沸水浴5 min;然后，在PCR板孔中加入45 μL的1 mol/ Tris-HCL（pH 8.0），沸水浴1 min;最后，再分别加入45 μL的TE（pH 8.0），静止片刻后吸取2.0 μL液体作为后续PCR反应模板[4]。 　　1.2.2
　　DNA指纹鉴定。PCR扩增引物采用SN/T3402-2012《两系杂交水稻与亲本真实性及品种纯度鉴定DNA分析法》中用于纯度鉴定的48对SSR多态性引物[5]。PCR扩增体系（总体积10 μL）：10×Buffer 1.0 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，50 ng/mL的上下游引物各0.2 μL，Tag酶0.6 μL，按上述方法制备DNA模板2.0 μL，ddH2O 5.8 μL。PCR扩增程序：95 ℃下预变性2 min，进行32次扩增反应循环：94 ℃下变性45 s，55 ℃下退火45 s，72℃下延伸1 min。然后72 ℃下延伸8 min，至最后10 ℃恒温。将PCR产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳及染色检测，观察胶片并记录结果[6]。
　　1.2.3 田间种植鉴定。每个批次在海南田间种植1个小区，每个小区种植400株，单苗移栽，并设亲本对照。在整个生长阶段检查小区的种植情况，观察品种的特征特性，注意减少化肥、除草剂的使用，以免影响植株的特征特性。在抽穗前及齐穗后依据GB/T 3543.5-1995《农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定》进行田间纯度鉴定，根据品种特征特性鉴定并记录下杂株类型和数量[7]。
　　2 结果与分析
　　2.1 “荃两优2118”F1种子特异性引物的筛选
　　试验参照行业标准SN/T 3402-2012《两系水稻品种真实性与纯度鉴定 DNA分析法》，对48对引物进行筛选，最后选择RM7120和RM8277作为“荃两优2118”F1种子纯度SSR鉴定引物。引物RM7120的上游为5′-TGCCCAAAATATATGAAACC-3′，下游为5′-TTTTCTTGTTGAATGGGAAC-3′;引物RM8277的上游为5′-AGCACAAGTAGGTGCATTTC-3′，下游为5′-ATTTGCCTGTGATGTAATAGC-3′。
　　2.2 DNA指纹鉴定与田间种植鉴定结果的比较
　　利用引物RM7120和RM8277对6批“荃两优2118”各96棵幼苗进行SSR分子标记鉴定，田间鉴定种植400株，结果见表1。从表1可以看出，SSR分子标记与田间鉴定结果比较接近，差值最大为2.05%，差值最小为0.23%。图1为利用引物RM7120进行SSR鉴定的电泳结果，M1、M2双亲的带型为单一带型，杂交种1、2、3、4、5、7、8为杂合带型并具有双亲的带型，自交结实的不育系6的带型与不育系M2一致。
　　3 结论与讨论
　　DNA分子标记技术直接分析遗传物质的多态性，其中SSR标记由于具有数量丰富、多态性高、遗传上的共显性、试验操作简单、结果稳定等优点，已成为杂交水稻种子纯度鉴定的一种理想分子标记[8]。相比较而言，田间种植鉴定是目前公认的杂交水稻种子纯度鉴定中比较可靠、准确的鉴定方法，也是国家标准规定的、目前鉴定杂交水稻种子纯度应用最广泛的方法之一[9]。
　　试验结果显示，SSR鉴定与田间鉴定所得杂交水稻种子纯度存在差异，并且差异的变化无规律可寻。这一方面是因为SSR标记可准确区分不育系和恢复系，但对于窜粉混杂和变异株较难区分，此外SSR鉴定的准确性也受到DNA提取质量、电泳操作和引物的影响;另一方面是因为田间种植鉴定的结果准确性受到鉴定者的经验、栽培管理、环境条件等因素干扰[6]。但总体来看，SSR鉴定与田间种植鉴定的结果十分接近。
　　对于企业而言，种子入库后到播种之前开始包装销售，而海南加代种植鉴定需要在次年4月份才能得到鉴定结果。为了给包装销售提供可靠的质量依据，就需要在室内先进行纯度鉴定。在实际操作中，应采用以室内鉴定为辅，田间鉴定为主的理念指导种子的生产加工。研究掌握室内检测与田间鉴定结果的关系可以更清楚地了解品种特性，而DNA指纹鉴定是一种快速、可靠、优良的杂交水稻种子纯度鉴定方法[10]。
　　参考文献
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　　[4] 王伟威，孟庆虹，张瑞英，等.5种主要农作物DNA快速提取方法研究[J].黑龙江农业科学，2008（5）：1-2.
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　　[8]曹栋栋，詹艳，王洋，等.杂交水稻种子纯度鉴定方法对比研究[J].浙江农业科学，2015，56（5）：718-722.
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　　[10]张雯，丁显萍，张萍，等.杂交水稻种子纯度DNA指纹鉴定与田间鉴定结果的比较[J].安徽农学通报，2018，24（13）：11-12.
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