基于DNA分子标记的植物功能基因的分离策略

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　　摘要：
　　随着分子生物学的发展，分子标记技术正变得越来越广泛，特别是在农艺领域，植物功能基因的分离大量的应用了该技术。未来的研究将探索分子标记技术的新应用，并使分子标记技术更加全面。基因是产生特定蛋白质的DNA序列，功能基因的分离有重要意义，本文综述了植物种群的分离，DNA文库的构建，基因库的构建，靶基因的分离和鉴定，以及基于DNA分子标记的植物功能基因的分离。
　　关键词：
　　分子标记；植物功能基因；基因分离
　　中图分类号：Q7
　　文献标识码：A
　　DOI：1019754/jnyyjs20190315012
　　前言
　　分离基因主要有正向遗传学和反向遗传学途径2种不同的途径。其中正向遗传学就是依靠目的基因本身所具备的功能鉴定基础之上对产物或者是某种表型突变来进行鉴定；后者通过基因组中的特定序列或位置集中于基因本身。传统的功能性克隆是基于已知基因的产物逆转其核苷酸序列，然后基于该序列设计探针或引物以筛选来自eDNA文库或基因组文库的克隆，属于前一类[1]。而先找到与靶基因紧密连锁的DNA分子标记，然后通过“行走”或“着陆”染色体克隆靶基因的方式属于反向遗传学即第2类。
　　1DNA分子标记在植物上的应用
　　有许多具有独特用途的分子标记，并且已经提出了植物中分子标记组合的实例。而分析标记概念从狭义角度上来讲就是DNA标记，可以对生物体或者是群体基因组中的一些差异DNA片段进行反应，分子标记概念能够很好的对基因组DNA之间的差异进行反应，其中一些非常常用的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。其中的EST是在mRNA的基础之上的分子标记。具体如下所示。
　　DNA分子标记技术与分子生物学的发展密切相关。由于DNA核酸内切酶的发现和DNA重组技术，基因定位突变，聚合酶链反应，DNA限制性内切酶片段长度多态性（Ran2），建立随机扩增多态性DNA（RAPD）和蛋白质工程，以制定分子生物学研究成果遗传学的理论研究和生物技术实际应用的各个方面正发挥着巨大的作用[3]。
　　2植物功能基因的分离策略
　　植物基因组DNA育种的特殊遗传群体是筛选与靶基因密切相关的分子标记的关键步骤。靶基因必须满足一些基本的条件：除了其所在基因组的局部区域外，基因组DNA序列的其余部分是相同的，并且在这些材料之间发现的多态性标记可以与靶基因紧密连锁。靶基因的近等基因系（NIL）是一组合格的物种，鉴于NIL的遗传组成，可能在近等基因系之间显示多态性的分子标记可能位于靶基因的2个翼附近。
　　21植物基因组DNA的提取方法
　　植物功能基因的提取是在基因层面的操作，现已在一定程度上有了较为成熟的方法，基因组DNA的提取是DNA分子标记的前提，只有将基因组的DNA提取出来了，才能对DNA分子进一步进行标记操作，才能使功能基因得到分离。在植物基因组DNA的提取技术上，科研工作者也做出了较多的努力，取得了较多的成果，较为成熟的方法也形成了一定的体系[4]。常见的DNA提取方法有：sDs法口；改良的SDS法；常规的CTAB法；高盐CTAB法；改良的CTAB法。
　　22 DNA分子标记方法
　　DNA分子标记是指通过DNA分子水平的技术和方法鉴定生物体之间的不同DNA片段作为遗传标记。其中可以将DNA分子按照标记方法的不同分为基于分子杂交的多态性比如说RFLP（Re—strietion Fragment Lensth Polymorphism），以及基于PCR反应的多态性如RAPD、SSR、AFLP、AP—PCR、DAF等共有2种标记类型。聚合酶链反应（PCR）是一种分子生物学技术，其中DNA聚合酶使用2个寡核苷酸作为引物来催化位于2个引物中的DNA片段的扩增。DNA分子标记技术本身是一种非常有效的手段在基因定位中应用非常广泛，而且在新阶段的基因分离和品种改良研究分析过程中也会起到一定的作用。随机扩增多态性DNA随机扩增多态性DNA（Random Amplifi，edPolymorphic DNA，RAPD）是由Wil—liams（1990年）和Welsh（1990年）各自独立提出的一种DNA多态性检测技术[5]。大量研究表明，SSR分子标记具有简单，稳定和良好的多态性。使用SSR标记的前提是理解重复序列侧翼的DNA序列，这使得该技术在应用上受到限制，但近年来这一进展迅速。
　　DNA分子标记的方式，主要包含了以下一些基本的操作：分离大片段阳性克隆的左端和右端，之后需要将其作为探针对基因组文库进行再次的筛选，所获得的新克隆则是沿着染色体的一种进步和发展。在染色体行走过程中所需要面临的主要问题就是一旦需要对一些无法克隆的片段进行传递时，就会使得步行过程出现中断现象。但在不断的研究过程中，发现可以通过染色体跳跃和连接等方法解决以上问题。而跳跃文库和连接库的构建主要由具有少量识别位点和大量识别位点2种不同的酶来完成的。其中skip文库的插入物是从同一文库中大片段克隆的双消化部分。一些具备的切割点的酶产生了连接文库的插入物，这些擦入物具备酶识别位点并且切割点较少。为能够进一步向靶基因靠近，可以将染色体步移中的跳跃以及结扎过程由2个文库交替来完成。
　　3结束语
　　现科学研究中已经利用DNA分子编辑实现了大量的植物功能基因的分離，随着科技研究的发展，随着各个领域的分子学水平的提高，该技术在基因分离上展示出了巨大的潜力和光明的前景。但是，中国与国际领先水平之间仍存在较大差距。推广其应用，利用先进的科技水平为人类的生活水平的提高带来益处。[JP]
　　参考文献
　　[1]
　　华丽霞，何炼，蒋秋平，等.稻瘟病抗性基因特异性分子标记的开发及应用进展[J].分子植物育种，2016，14（10）：2739-2748.
　　[2] 明金玉，李化丹，梁士博，等.植物功能性靶向基因标记的研究进展[J].中国生物工程杂志，2017，37（3）：83-91.
　　[3] 瞿印权，徐雯，何天友，等.DNA分子标记技术在竹亚科植物遗传多样性研究中的应用[J].安徽农业科学，2017，45（34）：45-47.
　　[4] 冯尚国，朱宇佳，焦凯丽，等.DNA分子标记技术在酸浆属药用植物中的应用研究[J].中国中药杂志，2018（4）：672-675.
　　[5] 刘立敏，韩多，李海峰，等.HPLC含量测定和DNA分子标记技术对重楼属药用植物的鉴定[J].辽宁中医杂志，2017（2）：355-359.
　　作者简介：
　　程曼（1987-），女，中级职称，山东，硕士研究生，研究方向：花卉组培及基因编辑。
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