SSR标记在玉米研究中的应用研究进展

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　　摘 要：简单重复序列作为第二代分子标记技术，在农作物分子辅助育种、种质资源鉴定等方面得到了广泛的应用。该文介绍了SSR标记引物开发及其原理，并对SSR标记在玉米种质资源遗传多样性分析、DNA指纹图谱构建、杂交种种子纯度鉴定以及杂种优势种群划分等方面的应用进行了综述，旨在为推进精准育种、缩短育种周期等提供参考。
　　关键词：玉米;简单重复序列;分子标记;标记辅助育种
　　中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）（02-03）-0013-04
　　当前，玉米作为粮饲兼用型作物在农业生产中发挥了不可取代的作用，并在饲料、工业等方面也有一定的应用[1-2]。截至2012年，我国玉米总产量超过了谷类产量，成为我国第一大粮食作物。而当前，我国玉米遗传育种仍是以传统常规育种为主，这种育种方式主要依据表型性状的观察，容易受到外界因素的影响。近年来，随着B73、Mo17等骨干玉米自交系基因组序列的公布，SSR等分子标记技术在玉米遺传育种方面得到了广泛的应用[3]。
　　1 SSR引物开发
　　随着引物开发软件的不断更新，不同物种引物设计的软件各不相同。在玉米引物开发上常用软件有Primer5.0、Oligo7、DNAsis等。NCBI、MaizeGDB等网站的BLAST选项中找到候选引物的原始序列，通过原始序列可对候选引物重新设计。引物设计的原则：候选引物长度最好在15～30、碱基的分布应符合随机性、候选引物序列中不可出现互补序列。现如今，MaizeGDB已经公开的玉米SSR引物约有2000对。SSR核心序列引物的来源有以下3个：（1）利用SSR序列两翼的保守序列，在基因文库中搜索选择出所需引物序列;（2）微卫星富集法[4];（3）利用计算机软件对核苷酸数据库中选择的引物进行引物设计。对所获得的引物用PCR进行扩增，所扩增出来目的片段的长短，取决于引物重复单元的重复次数。利用琼脂糖凝胶电泳，将所扩增出来的微卫星片段进行观察比较。杨珊等[5]利用20份自交材料的24个SSR引物中筛选出了4个对玉米耐盐碱性相关的SSR引物。李余良等[6]从玉米基因数据库中开发了251对SSR引物，电泳检测出12对关于雌穗发育差异的SSR引物多态性高。
　　2 SSR标记的原理与特点
　　SSR标记技术是以PCR为基础发展起来的第二代分子标记技术。SSR是由1～6个单核苷酸为重复单元串联在一起，在高等生物中均有SSR存在。然而，每个SSR序列的核心序列具有相同结构单元，在玉米基因组中常见的二核苷酸重复单元是（AC）n和（GA）n，这些重复单元以首尾相连的形式串联在一起，一般重复单元多为10～50个。SSR核心序列重复次数与该座位上的等位基因具有强烈的正相关性。不同数目重复单元串联在一起是生物高度多态性形成的主要原因。限制性片段长度多态性（RFLP）可以随机选择酶切位点，但是DNA探针选择是比较困难[7]。随机扩增长度多态性DNA（RAPD），该方法检测所需时间与之相比有所缩减，需要的DNA样品较少，但是该方法共显性差并且存在着共迁移的问题。扩增片段长度多态性（AFLP）虽说在稳定性和效率上有了一定的改善，但是实验所需费用与之相比并没有减少，对一些碱基差异较大但分子量相同的片段识别能力较差。综合以上几种标记方法，简单重复序列（SSR）有以下优点：（1）在真核生物基因组中均有分布，特别在高等生物中分布随机且广泛[8-9];（2）做SSR标记时，对DNA的需求量较少;（3）遵循原始遗传特性，具有共显性的特点[10];（4）做PCR分析时，对DNA的要求不高，尽管DNA已经出现了一定的降解，但是对测量结果也无影响;（5）设计的引物序列不同，决定了其相对应的等位基因不同的位点，这样可以方便交流，共同开发不同的引物[11]。
　　3 SSR标记在玉米中的应用
　　3.1 遗传多样性分析 中国是玉米种植大国，品种类型十分丰富，包括普通玉米品种、糯玉米品种、饲用玉米品种等[12]。王凤格等利用SSR标记对328份玉米品种的遗传多样性进行了分析，发现近年来育成品种遗传多样性指数在不同年份间变化不大，东华北及黄淮海地区存在品种同质化问题[13]。研究现有不同种质（品种）的遗传多样性，对深入剖析及挖掘优异品种的基因组成和提高育种效率具有重要的理论和实践意义[14-15]。关于我国种质资源情况，姚杰等[16-17]对我国的种质资源进行了搜集整理。分子标记的出现为遗传多样性分析提供了新的方法。近几年来，国内外学者对于SSR标记在玉米遗传育种上的应用开展了大量研究。例如，Zhu等[18]采用SSR标记技术对贵州的21份玉米进行了遗传多样性分析，结果表明，利用20对引物检测到了97个基因变异位点，在参与实验的21份玉米材料间平均遗传距离为0.43。Zheng等[19]采用SSR标记技术依托于UPGMA法进行了聚类分析，可将165份糯玉米材料划分为3大类群。张海剑[20]对玉米的弯孢叶斑病进行遗传多样性分析，为了解不同年份，不同地区的差异，该课题组进行2年多点取样，并利用筛选出13条引物对175个月弯孢菌做PCR扩增，得到多态性较高的条带105条。利用聚类分析法可将该菌分为2群5个亚群。刘洋等[21]对热带44份甜玉米作物的耐旱性进行筛选，对叶长、百粒重、株高等表型性状进行了遗传多样性分析。结果表明，在这44份材料中只有4份材料表型性状优良，耐旱性较强。张鹏等[22]利用SSR荧光标记法对云南省的玉米材料进行遗传多样性分析，在30对SSR引物对42份材料检测出了277个基因变异，每个位点平均检测出9.2个等位基因。李勤等[23]为了解巴山地区玉米的遗传多样性，利用SSR引物对26份玉米材料进行多态性分析，结果表明，检测到212个等位变异，每对引物可检测到8.83个等位变异。蒙祖庆[24]对西藏地区玉米地方品种与外地品种进行遗传多样性分析，经过2地玉米实验对比表明，西藏地区玉米的基因多样性明显高于国内其他地区。可见，SSR分子标记对明确玉米种质资源遗传的多样性、玉米育种材料的选择以及种质资源创新做出了重大贡献。 　　3.2 构建玉米DNA指纹图谱 开发适用于植物品种SSR指纹分析软件工具Genemapperhe和Genemarker，实现了植物品种SSR指纹分析的自动化和标准化[25]。DNA指纹鉴定类型包括自交系的溯祖、真实性鉴定、派生关系的鉴定。在农作物品种审定登记制度实施以来，审定品种数量呈现了“井喷式”的增长。相关数据表明，我国玉米的进口量逐年增加，新品种相对较少，需求量低于供给量[26]。现阶段面临的现状是新品种的选育同质化过于严重，导致玉米品种遗传基础狭窄;所育成的新品种与原有品种性状相似，很难区别品种之间的差异[27]。因此，玉米DNA指纹图谱构建成为了迫切的需求，玉米DNA指纹图谱构建对种质资源鉴定、育种者维权、纯度分析起到了重大作用。构建指纹图谱依据是每一个品种DNA组成不同，构建指纹图谱所选用的DNA带谱相对稳定，不受环境条件和地理条件的影响，所形成的数据库可纳入计算机软件进行系统式管理。玉米新品种所形成的DNA指纹库，可以为人们提供丰富、有价值的遗传信息[28]。王凤格等[29]利用筛选出的40对SSR核心引物对3998份中国审定的品种建立了DNA指纹库。邱洪波等[30]从34对核心引物中的6对引物建立起了喀斯特山区的指纹图谱。邸仕忠等[31]从重庆市66个玉米自交系几百对引物中，最终挑选出重复性较高的10对核心引物，完成了对重庆市66个玉米自交系的指纹图谱构建。刘涛等[32]、盖树鹏等[33]、吴渝生等[34]分别完成了黔东南地区、山东省、云南省骨干亲本的指纹图谱的构建。
　　3.3 杂交种种子纯度的鉴定 种子纯度是指种子在种植后所表现出来表型特征和生理生化指标的一致性，并且种子纯度的高低对种子质量的好坏起到了决定性作用[35-37]。玉米杂交种纯度的鉴定方法分为外在表型和生理生化指标2种，而所鉴定的对象一般是大田生产所用的未登记和审定的实验用种。外在表型鉴定包括对种子、幼苗和成年植株的农艺性状进行鉴定。这是我国使用最广泛的方法，具有直观、方便、操作简单的优点，但是目前我国育种同质化比较严重，导致不同品种间的农艺性状差异小，这对表型性状的鉴定造成了严重影响[38]。生化鉴定法包括同工酶鉴定和DNA分子标记鉴定2种。同工酶电泳法具有受环境因素影响小、快速、准确的优点。Yu等[39]利用玉米杂交种对酯酶同工酶进行了鉴定，并取得了良好的成果。近几年来，随着对分子生物学的了解越来越透彻，SSR标记在水稻[40]、西瓜[41]和玉米上也得到了广泛的应用。闫米阁等[42]将玉米杂交种强盛16、强盛9、强盛62的SSR引物选择出来，利用SSR标记技术准确有效的鉴定出了以上4个品种的纯度。李群等[43]选择9对引物在玉米杂交种登海11号和其父母本上进行试验，选择出了玉米杂交品种登海11号种子纯度鉴定的引物位点。李晓辉等[44]利用SSR分子标记技术对挑选出220对引物，通过电泳进一步实验选择出了58对引物用于13个杂交种种子纯度鉴定，结果表明，该方法可以将13个杂交种一一区分开。从常规鉴定和生化鉴定2个方面阐明了玉米杂交种纯度鉴定的方法，得出了SSR分子标记是目前种子纯度鉴定最适宜的方法[45]。
　　3.4 划分玉米杂种优势种群 杂种优势群是指子一代个体汇集了父母本的所有有利基因，群间自交系杂交，時往往可以将父母本的有利基因汇集在一起[46]。研究杂种优势种群关系对我国玉米种质资源的改良具有重要的意义[47]。祁志云等[48]以不同类群测验种自育自交系及美国种质共24份，采用不完全双列杂交设计，对供试材料进行了杂种优势群划分，结果表明，群间特殊配合力大于群内特殊配合力。骈跃斌等[49]为了解32份玉米自交系的杂种优势群的分类情况，按照UPGMA的方法对32份自交材料进行了聚类分析，将供试的32份自交系材料分为4个大类群。从杂种优势的实践上来看，双亲不属于同一类群的杂交种体现出了高产优质的特点，而双亲属于同一类群的杂交种未体现出这一特性。许崇香等[50]对黑龙江省的25个自交系进行了杂种优势种群的划分，通过UPGMA方法做聚类分析，可以将25份自交系材料分为4大类群。杜青等[51]等对广西省的33份骨干自交系进行了杂种优势群的划分，用已挑选的60对引物对33份自交系玉米进行了实验，结果表明，广西省的自交系来源多且遗传多样性好，杂种优势种群划分对杂种优势的利用起到了重大作用[52]。
　　4 展望
　　SSR标记技术是近几年发展起来理想的标记技术，具有巨大的应用前景。随着玉米基因组学的迅猛发展及分子育种实践的持续深入，SSR标记技术将会得到快速发展与改进[53-55]。SSR标记技术的深入应用，方便了育种者从分子层次上揭示表型性状与基因之间的关系。随着育种家们对SSR标记技术的运用日益熟练，开展了对玉米新抗逆基因的探索、种质资源的高效评价和高饱和度遗传连锁图谱的构建。但是，SSR标记所临的问题是开发新的SSR引物投入高、难度相对较大并且在构建玉米高密度遗传图谱时需要引入其他的标记技术。但未来随着科学家们对SSR标记技术运用程度的逐步加深，SSR标记技术面临的难题将会被逐一攻破。
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