发根农杆菌与绿色木霉对玉米幼苗根系生长的影响

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　　摘要：发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）在促进植物根系生长方面具有重要意义，而绿色木霉（Trichoderma viride）在抑制致病菌、促进作物生长等方面效果显著。为探讨发根农杆菌和绿色木霉对玉米根系生长的影响，明确二者协同增效效果及作用机制，采用盆栽法，设置发根农杆菌与绿色木霉2类菌株单一、复合接种作为试验组，以不施菌剂作为对照，共4组处理。测定接菌后玉米株高、茎粗、叶宽、叶绿素含量、根系指标等，探究菌剂单一处理、复合处理对玉米生长的促进效果。结果表明，菌剂复合处理与单施发根农杆菌、单施绿色木霉相比玉米生长指标明显提高;单施发根农杆菌、绿色木霉与对照相比根系生长差异明显，单一施加发根农杆菌、绿色木霉以及混合处理均可以显著提高玉米植株茎粗和叶绿素含量（SPAD值），但各试验组间均无显著性差异。说明3种处理均能促进玉米根系生长，但复合处理对玉米根系生长促进作用优于发根农杆菌和绿色木霉单一接种，说明玉米植株根系生长过程中二者可以起到协同促进作用。
　　 关键词：发根农杆菌;木霉菌;玉米;根系;促生作用
　　 中图分类号： S513.01  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）15-0112-06
　　玉米（Zea mays L.）为禾本科玉蜀黍属一年生单子叶植物，是典型的高产C4植物[1]，在我国农业经济中占有重要地位[2]，因此玉米品质与产量的提高始终是研究的热点。植物的根系是影响产量的重要器官，根系形态决定了植物获得的土地资源，同时也是影响养分吸收的重要因素[3]，进而影响植物地上部光合作用与生长发育[4]，与作物的品质和产量息息相关。玉米作为单株生产力较强的禾谷类作物，其强大的根系是成为高产作物的重要原因之一[5]。改变玉米根系特征促进作物生长是直接且有效的方法，目前许多栽培手段都是通过直接影响作物根系来实现作物高产的[6]。2005年徐洪伟等首次利用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染非天然寄主的单子叶植物玉米，成功培养了1种玉米新种质材料——玉米毛状根再生植株，其根系庞大且构型复杂，有利于吸收土壤中的水分和养分，从而使玉米获得较高产量[7]。刘爱荣等研究发现，木霉菌（Trichoderma spp.）可以促进根系发育提高作物产量，也能在一定程度上抵抗生物与非生物胁迫[8]。木霉菌主要的促生机制包括分泌类植物激素丁烯羟酸内酯以刺激作物根系伸长和活化土壤中的难溶养分磷、铁等元素[9]。前人研究发现，木霉菌株可以显著提高马鞭草产量，同样也可以促进番茄、豆类、黄瓜等农作物的生长[10]。2009年Metwally等研究证明，木霉菌可以改善洋葱的生长参数，如鲜质量、干质量、根、茎、叶面积以及叶绿素含量等[11]。Shahid等研究发现，木霉菌处理绿豆可使其产量提高29%[12]。可见木霉菌作为一种新型的生物促生剂，在生物防治与促进植物生长方面具有广阔的应用前景。但由于环境与植物本身的影响，木霉菌单独使用时生存能力和定殖能力较弱[13]，木霉菌通过定殖于根系外表皮，形成无毒的植物-木霉菌共生体调节植物新陈代谢实现促进作物生长[8]。目前已经证实发根农杆菌可有效促进玉米根系生长，但前人研究多集中于单一菌种的抗病或促生方面的作用[14-20]，而两者同时接种协同促进玉米植株生长的研究鲜有报道。本试验以玉米为研究对象，利用发根农杆菌、绿色木霉菌单一及复合接种，探究其对玉米幼苗根系生长的影响，以及二者能否发挥协同作用促进玉米植株根系生长，以期为高效生物有机肥的开发应用提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 供试材料
　　植物材料：玉米郑单958，由笔者所在实验室保存。
　　供试菌株：绿色木霉菌（Trichoderma viride），由笔者所在实验室保存，分离于四年生大田人参根部，该人参取自吉林省临江市四道沟镇岗头村，聚合酶链式反应（PCR）产物送至北科生物技术有限公司进行测序，將测得序列片段于美国国家生物信息中心（NCBI）网站进行基于局部比对搜索工具（BLAST）比对，确认为绿色木霉。发根农杆菌ATCC15834，由法国国家科学院生物技术与园艺研究中心Tepter博士惠赠[7]。
　　供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯葡萄糖（PD）培养液、LB固体培养基、LB液体培养基。
　　供试土壤：土壤取自梨树试验田，土质为黑土，经立式压力蒸汽灭菌器于121 ℃、0.22 MPa条件下灭菌 2 h，自然冷却备用。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 菌剂制备 发根农杆菌发酵液制备：将保存于-80 ℃超低温冰箱中的发根农杆菌ATCC15834于LB固体平板中划线培养，置于28 ℃暗培养2 d后挑取单菌落转入5 mL LB液体培养基中，于 26.8 ℃、166 r/min 暗培养活化24 h后，吸取0.5～1.0 mL菌液转入50 mL LB液体培养基中，于 26.8 ℃、166 r/min 黑暗振荡培养，反复进行3次活化，菌液在600 nm处的吸光度（D600 nm）为0.4～0.6。
　　绿色木霉发酵液制备：将绿色木霉接种于PDA培养基中，于28 ℃活化培养3～5 d产生绿色分生孢子，用无菌水冲洗分生孢子，使用血球计数板调节孢子浓度为5.0×108 CFU/mL，将分生孢子液按照5%的接种量转接入装有100 mL PD培养液的250 mL三角烧瓶，于 28 ℃、180 r/min摇床振荡培养3 d制成木霉菌发酵液，备用。
　　1.2.2 盆栽试验 试验于2019年5—7月在吉林省植物资源科学与绿色生产重点实验室内进行，取灭菌后的试验土装入塑料育苗盆（规格：28 cm×25 cm），每盆装土2 kg，加入已活化的菌液150 mL，混匀后待用。试验设置4个处理（对照，CK;单一发根农杆菌拌土处理，T1;单一绿色木霉拌土处理，T2;50%发根农杆菌+50%绿色木霉菌混合拌土处理，T3），每个处理均设3次生物学重复。播种前于45 ℃温水中浸泡玉米种子8 h，浸泡后种子洗净，用滤纸吸干表面多余水分，均匀地放置于铺有湿润滤纸的培养皿上，保持滤纸湿润，于28 ℃恒温培养箱中暗培养 24 h。选取大小一致的露白玉米种子，每盆播种4穴，每穴2粒，待玉米植株2叶期时定植，每盆4株。生长期间正常浇水，使土壤基本保持湿润状态。 　　1.2.3 测定指标与方法 于玉米植株4叶1心期时测定以下指标：（1）茎粗：子叶节下1 cm处粗度，用游标卡尺测定;（2）叶宽、株高，用直尺测定;（3）叶绿素含量（SPAD值）的测定：选择生长状态良好且长势一致的玉米植株，清除叶片表面尘土，每张叶片的相同位置选取6个测量点，采用 TYS-A型叶绿素测定仪测定叶片的叶绿素含量（SPAD值），记录的数据取平均值;（4）根系形态学指标的测定：将洗净的玉米根系放入20 cm×40 cm的根盘中置于扫描仪上，在根盘中添加高度为5～10 mm的水，使水面恰好全部没过根系，用仪器遮光板全部覆盖住根盘，进行根系全景扫描。待扫描完成，通过Win RHIZO图像查看软件，调节阈值使效果最佳，获得如下指标：总投影面积、总根长、总根表面积、平均根系直径、根尖数、分枝数、交叉数、总根体积等。
　　1.2.4 数据统计与分析 用Excel处理试验数据、作图，利用SPSS 22.0软件中最小显著差异法（least significant difference，LSD）对数据进行多重比较（P<0.05）分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 发根农杆菌、绿色木霉菌处理对玉米地上部植物学性状的影响
　　从图1可以看出，发根农杆菌、绿色木霉单一接种、混合接种对玉米幼苗茎部和叶片发育均有促进作用。施加发根农杆菌处理（T1）的玉米植株茎粗、叶绿素含量都显著高于对照处理（P<0.05），分别提高41.1%、88.2%（图1-A、 图1-D）;株高和叶宽虽与对照差异不显著，但趋势一致，分别提高22.6%、18.0%（图1-C、图1-B）。施加绿色木霉处理（T2）与对照组相比叶宽没有显著提高，但株高（图1-C）、茎粗（图1-A）、SPAD值（图1-D）显著提高，分别提高28.4%、42.8%、60.6%。施加发根农杆菌和绿色木霉复合处理（T3）茎粗、SPAD值与对照差异显著，分别提高38.6%、63.7%（图1-A、图1-D），株高、叶宽与对照差异不显著，但均高于对照（图1-B。图1-C）。
　　 叶绿素含量反映植株光合速率跟碳水化合物累积的关系，叶绿素含量与植株对光能的利用效率呈正相关关系[21]。表1结果显示，3种处理SPAD值均显著高于对照组，说明施加发根农杆菌、绿色木霉、发根农杆菌和绿色木霉联合施用处理均可促进玉米植株的光合作用，有利于化合物的积累。从茎粗来看，与CK相比试验组对玉米幼苗横向生长发育具有显著的促进作用，表明3种处理均可显著提高玉米幼苗茎部素质，进而利于提高植株健壮程度。
　　2.2 发根农杆菌、绿色木霉菌处理对玉米根系吸收范围的影响
　　根是影响植物产量的重要器官[22]，根形态决定了植物可获得的土地资源，好的根系形态有利于土壤养分的吸收[23]。根表面积和根总投影面积反映植物与土壤的接触面，与根系吸收水分、养分含量和吸收能力息息相关[24]。由表2可知，与对照相比，施加发根农杆菌玉米植株总根表面积显著增加29.6%，总投影面积比对照大但差异不显著;施加绿色木霉玉米植株总根表面积显著提高47.4%;施加发根农杆菌、绿色木霉复合处理比单独施加发根农杆菌根系增长效果更好，总根表面积和总投影面积分别提高22.3%、16.5%（图2），说明绿色木霉可能具有协助发根农杆菌发挥作用促进植株根系吸收面积增大的作用。
　　 根长可反映根系的延伸范围，根系的纵向扩展延伸有利于植物吸收深层土壤的水分和养分，总根体积可反映植株根系健壮程度[25]，发达而健壮的根系是作物高产的基础。如图3所示，与对照相比，施加发根农杆菌玉米植株的总根长、总根体积差异不显著，分别提高34.7%、45.9%;施加绿色木霉玉米植株总根长提高74.0%，总根体积增长1.65倍，且显著高于对照;施加发根农杆菌和绿色木霉复合处理比单独施加发根农杆菌处理增长效果更好，总根长显著提高43.1%，总根体积显著提高250.4%。
　　结果表明，单独施加发根农杆菌、绿色木霉和混合接种都能够促进玉米幼苗的根系生长，增加根长、总根体积、总根表面积，促进根系横向增粗和纵向伸长，扩大根系吸收面积范围，其中发根农杆菌和绿色木霉复合处理效果最佳。
　　2.3 发根农杆菌、绿色木霉菌处理对玉米根系吸收功效的影响
　　根系交叉数、分枝数、根尖数反映了植物根系吸收能力的强弱[24]，而根系直径可反映植物根系总吸收功效，与植株对土壤水分和养分的吸收能力息息相关[26]。如图4所示，单独施加发根农杆菌玉米和施加绿色木霉玉米植株根尖数、交叉数、分枝数、平均根系直径与对照均无显著性差异，但比对照高;发根农杆菌、绿色木霉复合处理玉米植株比单独施加发根农杆菌增效更佳，根尖数、交叉数、分枝数、平均根系直径分别增长83.8%、86.4%、67.5%、142.5%。结果表明，单一施加发根农杆菌、绿色木霉和混合接种都能够提高植株根系吸收能力，但发根农杆菌和绿色木霉复合处理效果最佳。
　　3 讨论
　　3.1 施加单一菌剂对玉米地上部生长的促进作用
　　木霉菌用于无病原体的土壤，会引起幼苗出苗率、株高、干质量的增加[27-28]。Samantha等分离鉴定的木霉菌株可使植物叶绿素含量增加6.8%，植物生物量增加4.5%，且植株根系显著发育[29]，本试验结果与之一致。结果显示，施加发根农杆菌处理的玉米植株茎粗、叶绿素含量分别提高41.1%、88.2%，显著高于对照组，株高和叶宽虽与对照差异不显著，但分别提高22.6%、18.0%。施加绿色木霉处理与对照组相比，株高、茎粗、SPAD值显著提高， 分别提高28.4%、42.8%、60.6%。说明单一施加2种菌剂均可显著促进玉米植株地上部的生长。
　　3.2 施加单一菌剂对玉米根系吸收能力的促进作用
　　玉米根系是作物吸收水分和养分的主要器官，前人研究认为，增加玉米苗期根长，扩大根系体积、根系吸收表面积，有利于根系对营养的吸收利用[22]。Yedidia等在黄瓜播种后28 d施加木霉菌T203，使黄瓜植株根体积、植株干质量分别增加95%、80%[30]。褚长彬等研究发现，经木霉发酵液处理的绿豆插条不定根提早2 d出现，并且在根数、根长、根生物量等方面都优于对照[31]。本试验发现，与对照相比，施加发根农杆菌总根表面积显著增加29.6%，总投影面积、总根长、总根体积、根尖数、交叉数、分枝数、平均根系直径均高于对照且增幅较大;施加绿色木霉玉米植株根系表面积、总根长、总根体积显著高于对照，总投影面积、根尖数、交叉数、分枝数和平均根系直径与对照差异不显著但均远高于对照，結果表明施加发根农杆菌和施加绿色木霉可以明显促进玉米根系对水分和养分的吸收能力。 　　3.3 綠色木霉与发根农杆菌的协同增效作用
　　研究发现，施加发根农杆菌和绿色木霉复合处理与单独施加发根农杆菌处理对玉米地上部植物学性状的影响无显著性差异;但对玉米根系增长的影响存在显著性差异，复合处理总根表面积和总投影面积分别比单施发根农杆菌提高22.3%、16.5%;施加发根农杆菌和绿色木霉复合处理与施加发根农杆菌处理相比，玉米植株总根长显著提高43.1%，总根体积显著提高250.4%，说明绿色木霉可能具有协助发根农杆菌发挥作用增大玉米植株根系吸收面积的作用。施加发根农杆菌和绿色木霉复合处理玉米植株与施加发根农杆菌相比，玉米植株根尖数、交叉数、分枝数和平均根系直径分别增长41.2%、87.2%、73.7%、142.5%。说明绿色木霉和发根农杆菌对玉米根系吸收功效的提高存在增效作用，其机制目前仍在研究中。
　　4 结论
　　单一施加发根农杆菌与绿色木霉可以通过提高玉米茎部素质、增大植株根系增强玉米植株健壮程度、增加作物养分吸收范围、促进植株生长，进而实现提高作物产量的目的。
　　混合施加发根农杆菌和绿色木霉可以发挥协同作用促进玉米植株根系生长，且与施加单一菌剂差异明显，说明绿色木霉对发根农杆菌存在增效作用。本试验结果为生物有机肥的后期开发与研究提供了理论基础，对绿色农业生产具有重要意义。
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