银离子和半胱氨酸传感器的设计
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一、综述
在生物体系中，Ag+是一种重要的金属离子，由于Ag+的抗菌活性和它与核酸的相互作用，一直以来很受关注。近期，李涛等报道了一种利用G-四链体-hemin DNA酶比色法检测溶液中Ag+和Cys的方法。这种方法是利用Ag+能够与DNA二倍体/双链结构中的两个错配胞嘧啶碱基C结合，形成C-Ag+-C金屬碱基对，使错配的C-C碱基对更稳定，从而增强G-四链体-hemin配合物的过氧化物酶活性。这种方法的检测结果很好，其中Ag+检测体系的检测限可达2.5 nM，但是由于反应体系的最大吸光度值仅为0.08，所以需要灵敏度很高的检测仪器，同时要求操作技术精准。本工作中，我们设计了一种高灵敏度、高选择性的Ag+定量检测方法，但是检测原理与李涛等报道的方法完全不同。我们的检测方法是基于Ag+对G-四链体结构的破坏作用。检测体系吸光信号的差值可达0.45。由于Ag+与Cys具有很强的结合能力，使被Ag+破坏的G-四链体可以重新形成，利用这个过程通过简单的比色测定可设计一种Cys的灵敏检测方法。由于Ag+检测体系和Cys检测体系在检测过程中都可以产生较大的信号变化，反应体系颜色的改变能够用肉眼即可观察，因此可以设计一种简单的肉眼检测Ag+和Cys的方法。
二、仪器与试剂
TC-48/H（t）型基因扩增热循环仪（杭州博日科技有限公司）
UV-1901紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）
Jasco J-820分光偏振计
UB-7 PH酸度计（北京赛多利斯科技仪器有限公司）
TGL-16C高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）
H-1微式混合器（上海强运科技有限公司）
BS124S电子天平（北京赛多利斯科技仪器有限公司）
数码相机（尼康）
DNA从上海生工生物技术有限公司定制合成;H2O2，Triton X-100，hemin，Tris（三（羟甲基）氨基甲烷），氨基酸，谷胱甘肽，ABTS，DMSO（二甲亚砜），HAc，KAc，AgNO3，Mg（NO3）2，Cu（NO3）2，Mn（Ac）2，Zn（Ac）2，Cr（NO3）3，Pb（NO3）2，Ni（NO3）2，Co（Ac）2，Cd（NO3）2，Fe（NO3）3，Hg（Ac）2，Ca（Ac）2均从Sigma公司购买。纯度均为分析纯。
DNA溶液的配制：溶于二次去离子水中，寡核苷酸的浓度以单链浓度的形式表示，其浓度通过测量260nm处的吸光度再根据对应的消光系数计算得到。
hemin溶液的配制：称取0.01304g的hemin，溶于4mLDMSO中，使用时根据需要稀释。
本实验所用到的核苷酸链为：CatG4：5′-TGGGTAGGGCGGGTTG
GGAAA
三、结果与讨论
（一）Ag+和半胱氨酸（Cys）检测体系的设计
G-四链体是由具有连续G序列的DNA形成的一种特殊的核酸二级结构，它是由四个鸟嘌呤碱基G通过Hoogsteen氢键的配对方式首尾连接构成平面的G-四分体（图1A），相邻的G-四分体平面之间又通过-堆积作用而形成的。据报道，Ag+与鸟嘌呤碱基G之间能够以螯合的方式结合（图1B），而结合位点恰恰是G-四链体中Hoogsteen氢键的形成位点。因此，Ag+与鸟嘌呤碱基G的结合可以阻碍G-四链体的形成，从而抑制G-四链体-hemin DNA酶的过氧化物酶活性（图1C）。我们假设如果体系中过氧化物酶活性的降低取决于Ag+的浓度变化，那么就可以设计一种新的检测Ag+的方法。Ag+具有抗菌活性，其抗菌原理主要是Ag+和硫醇键相结合，从而杀死细菌。Cys是一种生命体内常见的含硫氨基酸，通过二硫键使蛋白质分子内部交联。Cys中的巯基（-SH）能够与Ag+结合从而抑制了Ag+的活性，因此基于G-四链体与Cys对Ag+的竞争，可将上述Ag+的检测方法进行进一步设计用于Cys的检测。Cys检测方法的原理如图1C所示。Ag+优先与Cys结合，因此Cys能够将寡核苷酸链中与G碱基络合的Ag+置换出来，G-四链体重新形成，结果应使检测体系的过氧化物酶活性增强。如果检测体系的过氧化物酶活性能够随着Cys浓度的增加而增强，那么基于这一反应就可以设计一种新的检测Cys的方法。为了验证上述假设是否成立，我们对Ag+和Cys加入前后CatG4的圆二色（CD）光谱的变化进行了比较（图2），不加Ag+时，CatG4的CD光谱在265nm附近有一个正的吸收峰，表明CatG4形成了平行的G-四链体。而加入Ag+后，CatG4的CD光谱信号强度急剧下降，表明CatG4形成的G-四链体结构被破坏，与预期一致。Cys自身没有CD信号，但是向CatG4/Ag+混合物加入Cys后，CD信号明显增强，这表明G-四链体结构又重新形成。然后向上述溶液中分别加入hemin后再做CD光谱，CD光谱的吸收峰与不加hemin的基本一致，这表明hemin的存在与否对Ag+和CatG4的相互作用没有影响。
另外我们还研究了Ag+和Cys对过氧化物酶活性的影响，从图3A可以看出，hemin自身的过氧化物酶活性很弱，而CatG4与hemin形成的配合物具有很强的过氧化物酶活性，能够有效的催化H2O2氧化ABTS的反应，反应产物ABTS˙+在422nm处有最大吸收。同时，反应混合物呈现特征绿色。向CatG4溶液中加入Ag+（终浓度为3μM）后，体系的吸光信号急剧下降，几乎与背景吸收值接近，反应混合物基本无色。2μM Cys的加入使体系的过氧化物活性明显提高。这一实验现象与图1C所示反应原理完全吻合。本工作中采用的是ABTS-H2O2的反应体系，Ag+的加入导致吸收信号降低了将近0.45，这个变化通过肉眼就可以观察到（图3B）。因此，利用这个结果可以开发一种简单的肉眼检测Ag+和Cys的方法。
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