梨休眠芽超低温保存研究
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摘 要：本次实验以梨休眠芽为材料研究了干燥时间、预处理时间、PVS2装载时间及解冻方式对超低温保存后梨休眠芽再生率的影响。结果表明，休眠芽干燥12h，先用60%PVS2预处理20min，再用100%PVS2处理20min，取出后用43℃水浴解冻3min，然后用MS+0.4mol/L蔗糖溶液清洗，接种在再生培养基试管中，进行光照培养，可获得较高的萌发率。相同条件下用43℃水浴解冻比流水解冻好。
关键词：梨休眠芽;超低温保存
茎尖分生组织超低温（-196℃）保存技术是种质资源长期保存的理想技术，它既实现了对种质资源的长期保存，同时可以快速进行无性繁殖，减少了材料的遗传变异性。近年来随着国内外对超低温保存研究的不断发展，逐步发展有干冻法、预培养法、玻璃化法、包埋脱水法等超低温保存技术。到目前为止，采用超低温保存技术已经在苹果、扁桃等近千种植物材料成功进行了超低温保存，超低温保存休眠芽的效果往往比其他组织器官还好，而且容易通过丛生芽途径再生植株。本试验拟对以梨休眠芽为外植体的超低温保存进行研究，找出有利于梨休眠芽超低温保存的最优方案，为梨在林业中的应用以及梨树种质资源的长期保存提供支撑。
一、材料与方法
（一）实验材料
本实验材料采集时间为2018年11月中旬。长度约10cm带休眠芽的枝条若干枝，取回实验室立即进行实验处理。
（二）实验方法
1.梨休眠芽外植体灭菌。将休眠芽带一点木质部切下，剥去1～2层鳞片放入烧杯，用流水冲洗干净后转移到小锥形瓶中，加75%酒精清洗2次，再加无菌水清洗，而后加0.1%升汞，滴1滴吐温-80，盖上盖子浸泡3min倒掉，而后加入无菌水清洗5次，时间分别30s，3min，3min，5min，3min。然后开始剥芽2mm左右，放入培养皿中待用。
2.培养基的配制及灭菌。将各种器皿洗净放在指定位置。首先用量筒量取所需的母液按顺序加入1000mL搪瓷杯中搅拌，然后加入1.5mg/L6-BA和0.5mg/LIBA，加入称取的蔗糖和适量无菌水并不断搅拌至溶解，加水定容到1000mL，用氢氧化钠或稀盐酸pH调值为6.0。加入琼脂，在电磁炉上加热搅拌使其完全溶解。然后将培养基分装到三角瓶中并封好瓶口，放入高压灭菌锅灭菌中（气压121℃，时间18min）灭菌。灭好菌后取出培养基，用注射器加入0.5mg/LGA到三角瓶中，攪拌并分装到已灭好菌的平底试管中，平放凝固后接种用。
3.实验处理与再生。本实验通过干燥时间、预处理时间、PVS2处理时间、解冻方式等4个维度进行对照试验，每1个处理重复3次，每个重复含10个休眠芽。经过干燥、预处理、PVS2处理、解冻等处理过程，最后将处理后的材料用MS+0.4mol/L蔗糖溶液清洗2次，然后进行恢复培养，每1个茎尖单独接种于含有MS+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+0.5mg/LGA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉培养基的平底试管中，光照培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx的条件下进行，光照时间14h/d，30d后统计数据。
二、结果与分析
（一）干燥时间对超低温保存的影响
从表1可知，不经过干燥和干燥8h的芽全部被污染，萌发率都为0.00±0.00b。干燥12、16、20h休眠芽都有一定的萌发率，随着干燥时间延长，休眠芽的萌发率也开始逐渐降低，到20h的时候，萌发率只有43.33±0.15a。干燥时间长短对休眠芽超低温保存后萌发率有一定的影响。干燥12h梨树休眠芽萌发率最高，为60.00±0.17a。由此可以得出干燥12h为梨休眠芽萌发的最佳时间。
（二）预处理时间对超低温保存的影响
从表2可以看出，以干燥20h的休眠芽为材料进行预处理，预处理10min，萌芽率最高，可达到56.67±0.05a，不经过预处理和预处理20min的萌芽率都低于预处理10min的萌芽率相同，经过预处理10min的休眠芽恢复培养后植株生长势良好。由此得出，同等条件下预处理10min对梨休眠芽萌发最佳。
（三）PVS2处理时间对超低温保存的影响
从表3可以得出，同样以干燥20h的休眠芽为材料，不经过PVS2处理萌发率可到达46.67±0.11a，处理10min和处理20min的污染率更高，PVS2处理时间过长，对休眠芽有一定的伤害，导致萌芽率的降低。
（四）不同解冻方式对超低温保存的影响
从表4可知，水浴解冻方式萌芽率可达到43.33±0.12，而相同条件下流水解冻方式的萌芽率只有36.67±0.23，由此的出，对于梨休眠芽超低温保存的萌发率来说，水浴解冻方式优于流水解冻的方式。
三、讨论
适当的干燥时间对梨休眠芽超低温保存后休眠芽的萌发率有一定的提高。含水量的多少直接影响超低温保存是实现超低温保存的关键，不同植物的超低温保存适宜含水量不同。本实验主要是探讨干燥时间对梨休眠芽萌发率的影响，通过本次实验研究得梨休眠芽最佳干燥时间为12h，萌发率为60%。预处理时间对梨休眠芽超低温保存后的萌发率有不同程度的影响，通过实验分析，60%PVS2预处理和PVS2同时处理20min，梨休眠芽的萌发率可到60%。
解冻方式的不同对超低温保存后梨休眠芽的萌发也有一定的影响，本实验经分析得出，相同条件下水浴解冻后梨休眠芽的萌发率高于流水解冻的萌发率，得出水浴解冻方式优于流水。
梨休眠芽经过超低温保存的萌发率高，而且再生植株的遗传性也很稳定，生长势良好，因此可以作为一种长久有效保存休眠芽的方法。
参考文献：
[1]周权男，孙爱花，李哲，等.木本植物超低温冷冻保存研究进展[J].中国农学通报，2010（06）：93-96.
[2]吴永杰，赵艳华，周明德.苹果休眠茎尖的超低温保存研究[J].华北农学报，1999，14（1）：129-133.
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