遗传性血色病的实验室诊断
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【摘要】目的：探讨遗传性血色病的临床特点，评价血清铁指标、MRI、肝穿病理学检查在遗传性血色病诊断中的作用，并对遗传性血色病的相关疾病基因HFE进行突变分析。方法：患者，女。因肝功异常就诊，进行临床、血清铁指标、胸腹部MRI、病理组织学和特殊染色的观察，并通过PCR及DNA序列测定等方法对与该病相关的HFE基因进行分析。结果：转铁蛋白饱和度、铁蛋白异常;肝穿病理检查，肝铁沉积过多;胸腹部MRI显示肝脏有金属沉积;该病相关的HFE基因突变位点有待进一步查找。结论：遗传性血色病患者在我国较少见，临床特点不明显，诊断困难，尤其是遗传性血色病早期患者更难诊断，通过分子生物学方法诊断该病将变得更为重要。以上探讨为该病的进一步研究奠定了基础。
【关键词】遗传性血色病;HFE基因;MRI;肝脏;诊断
遗传性血色病最先在1935年由Sheldon系统描述，其症状常在成年后才表现出来，且无特异性，诊断较困难。其诊断方法仍然主要依赖患者的临床表现，包括临床起病特点、多实质脏器功能损害的临床表现等以及家族史、有无近亲婚配史、遗传方式、影像学检查和机体铁负荷程度检测（尤其是血清转铁蛋白饱和度、铁蛋白水平和肝铁含量测定）。Feder等（1996）把遗传性血色病基因限定在多态性位点D6S2238和D6S2241之间的240kb的范围内，并在该区域内克隆了遗传性血色病基因全长CDNA，鉴于遗传性血色病基因与HLA家族基因具有较高的同源性，故把遗传性血色病基因命名为HLA-H基因，且发现遗传性血色病基因突变是本病患者发病的分子遗传学基础。患者通过临床诊断为遗传性血色病，为了找到该病的基因突变为点，根据文献报道和研究发现HFE基因变异是遗传性血色病的主要发病原因，故从HFE基因入手进行筛查。
1资料与方法
1.1一般资料
患者，女，22岁，有一妹17岁患糖尿病夭折，因肝功异常就诊。从患者的临床表现、影像学检查、机体铁负荷程度检测（尤其是血清转铁蛋白饱和度、铁蛋白水平和肝铁含量测定）等各方面进行诊断。其皮肤黏膜色素有沉着，经铁生化指标检测、MRI及肝穿诊断为遗传性血色病。
遗传性血色病的诊断标准：
（1）排除引起继发性血色病（溶血性贫血、多次大量输血、慢性肝病等）的疾病;
（2）参照美国肝病学会关于遗传性血色病诊治指南的建议：存在遗传性血色病的症状或体征，和（或）铁生化指标异常;肝穿病理学检查证实铁的沉积或腹部磁共振（MRI）证实肝脏大量铁沉积;
（3）结合遗传病学家系调查。
1.2方法
（1）患者检查血清铁（SD、血清铁蛋白（SF）、转铁蛋白饱和度（TS）、血常规、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）和血糖。行肝穿病理学检查，肝组织行HE染色，并做了腹部MRI、CT和彩色B超。
（2）采用碘化钾法提取外周静脉血白细胞DNA。设计6对PCR引物（上海生工公司合成），扩增HFE基因6个外显子，PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃，30s;55℃，30s;72℃，30s;共35个循环，最后一个循环结束后继续在72℃延伸5min。取PCR产物5u1在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，100伏电压下电泳40分钟后，用Fluor-S凝胶成像系统进行照相，看电泳条带是否与预期大小相符。PCR产物按常规在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，此时应保证电泳缓冲液为新鲜配置的，100伏电压下电泳40分钟后，在紫外灯下切下含预期区带的凝胶块，用上海生工公司的胶回收试剂盒回收DNA。PCR产物纯化后，以相应引物，委托上海生工公司在ABI PRISM 3730上进行DNA序列测定。
2结果
（1）患者血清铁（SI）、血清铁蛋白（SF）、转铁蛋白饱和度（TS）均偏高。
（2）肝臟穿刺术，肝脏病理回报：肝小叶结构局灶存在，局灶紊乱，肝细胞内可见大量大小不等的高密度脂褐素沉积，其中可见细小颗粒状物质，有的颗粒弥漫分布，有的聚集成堆，有时可见单位膜包绕，脂褐素主要集中在毛细胆管附近，部分肝细胞脂滴存在，肝细胞核及其他细胞器无明显异常窦间隙内及小叶间纤维组织增生无炎症细胞浸润。送检的组织中间2个汇管区明显增大，纤维组织增生，弓形纤维形成，少许炎症细胞浸润。结合临床及电镜超微结构特点诊断血色病伴肝纤维化。
（3）腹部MR/和彩色超声诊断。
超声所见：肝脏形态正常，左肝大小10.24x3.64cm，右肝肋间厚约11.56cm，实质回声，肝门处探及多个实性偏低回声区，较大约1.53x1.20cm，边界清，胆囊，胰腺，脾脏正常。
超声诊断：肝门处多发实性肿块，考虑肿大淋巴结，肝、胆、胰、脾未见异常。
磁共振（上腹部）肝脏大小形态正常，左右肝比例正常，边沿光整，肝内信号普遍下降，于T1WI及T2WI上均呈低信号尚均匀，增强扫描普遍无强化，肝门区有轻度片状强化（此两处强化可能为正常的肝岛），提示有重金属类沉积。
（4）腹部CT显示肝脏有高密度物质沉积。
（5）琼脂糖凝胶电泳分析片断大小。
PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳时，出现特异性区带分别为：El：300bp;E2：396bp;E3：500bp;E4：390bp;E5：348bp;E6：220bp，与预期大小相符
（6）序列比对分析结果。应用PCR及测序方法对一例遗传性血色病家系先证者的HFE基因进行突变分析，在其HFE基因全长编码区均未发现突变位点
3讨论
遗传性血色病在西方国家常见，近年来，随着HFE基因、HJV基因、转铁蛋白受体2（TfR2）、膜铁转运蛋白（FPI）和铁调素的相继发现，遗传性血色病的相关研究获得突破性进展。遗传性血色病可能在白种人中是最常见的常染色体隐性遗传性疾病。以上资料结果显示，该名患者应考虑遗传性血色病的可能，一旦遗传性血色病诊断明确，应详细询问家族史，及时行家系筛查，并争取早发现、早诊断、早治疗。遗传性血色病采用的放血治疗，并不为早期患者所接受。铁螯合剂疗效有限，毒性较大，价格贵。随着人们对铁代谢生理机制认识的深入。新型祛铁药物将会更好地为HHC患者服务。
分子诊断不仅可以确定患者的基因突变位点、突变类型、氨基酸改变情况和患者家系其他成员的基因型，还可以为遗传咨询、产前诊断提供依据。本研究从基因组DNA途径入手，应用PCR及测序方法对一例遗传性血色病家系先证者的HFE基因进行突变分析，在其HFE基因全长编码区均未发现突变位点。进一步验证了TsuiWM和Koyama C等人的观点。根据国内外研究资料，还需要从其他的遗传性血色病相关基因上去寻找突变位点。一定规模的HHC相关基因的调节也是迫切需要尽早开展的。这样的研究可以使我们能较为清晰地了解我国HHC疾病的发生率及相关基因突变类型，有利于开展更为深入的治疗学研究。
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