肺炎支原体实验室诊断的研究进展
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摘要：肺炎支原体（MP）是一种常见的呼吸系统感染病原体，约占儿童社区获得性肺炎病例的40%。MP不仅引起肺部病变，也能侵犯心、脑、肝、肾等其他器官，引起多种肺外表现。然而MP感染临床表现不具有特征性，临床上亦缺乏早期有效的诊断方法，容易和其他病毒、细菌所致的呼吸道感染相混淆。目前MP的实验室诊断方法不断推陈出新，但各种方法均有其优势与不足，本文对此作一简要综述。
关键词：肺炎支原体;实验室诊断;血清学诊断;基因学诊断
中图分类号：R725.6 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.11.008
文章編号：1006-1959（2019）11-0026-03
Abstract：Mycoplasma pneumoniae （MP） is a common respiratory infection， accounting for approximately 40% of cases of childhood community acquired pneumonia. MP not only causes lung lesions， but also invades other organs such as heart， brain， liver， kidney， etc.， causing a variety of extrapulmonary manifestations. However， the clinical manifestations of MP infection are not characteristic， and there is a lack of early and effective diagnostic methods in clinical practice， which is easily confused with respiratory infections caused by other viruses and bacteria. At present， the laboratory diagnostic methods of MP are constantly being updated， but each method has its advantages and disadvantages. This paper gives a brief overview.
Key words：Mycoplasma pneumoniae;Laboratory diagnosis;Serological diagnosis;Genetic diagnosis
肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是一种常见的呼吸系统感染病原体，是社区获得性肺炎最主要的病原体之一，可通过飞沫或直接接触感染，在儿童社区获得性肺炎中有40%由MP引起，在成人获得性肺炎中10.60%～25.82%由MP引起，在卧床患者中，其感染率更高，可达到29.4%。其可引起上呼吸道感染、支气管炎、肺炎，也可引起严重的肺外并发症[1]。近年来MP肺炎发病率有逐年增高趋势，且难治性或重症MP肺炎病例增多，给儿童、老人等免疫低下人群的健康带来巨大威胁。MP感染临床表现不具有特异性，易和其他病毒、细菌所致的呼吸道感染相混淆。由于MP缺乏细胞壁，使其对影响细胞壁合成的抗生素具有耐药性，头孢及青霉素类抗生素治疗无效，因此应选择抑制或影响蛋白质和核酸合成的药物来治疗，如大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类。目前大环内酯类是首选药物，喹诺酮类和四环素类不推荐用于儿童和孕妇临床治疗。随着首选药物广泛应用，耐药现象也日益严重[2]。因此，早期确诊MP感染，及时、正确用药，减少并预防耐药性，具有重要的意义。现对MP的主要实验室诊断方法综述如下。
1分离培养
MP分离培养包括液体培养法和固体培养法。液体培养法利用MP代谢产物使培养液中指示剂颜色发生改变（由红变黄为阳性）而鉴定;固体培养法根据显微镜下菌落形态呈煎蛋样进行鉴别[3]。传统液固二步培养法曾是WHO推荐的诊断金标准，但MP自身无法合成甾醇，培养成本高，生长极缓慢，约2～4周，很难在临床推广。目前临床上使用的快速液体培养法虽能在24～48 h完成诊断[4]，但培养基中加入的青霉素和醋酸铊等物质无法抑制真菌和其他杂菌的生长，易产生假阳性。She RC等[5]对分离培养在MP感染的临床诊断意义进行了评估，结果显示与血清学和基因学检测相比，分离培养法的灵敏度更低且耗时长，故此法不适于此类病原体的诊断。
2血清学检测
双份血清学抗体滴度升高4倍以上是诊断MP感染的金标准，但收样困难、耗时，不利于临床医生及时制定治疗方案。MP包括抗原检测和抗体检测，其中抗原检测灵敏度低，易与呼吸道其他病原体出现交叉反应，临床应用受限。MP侵入机体后，可引起免疫应答产生相应的抗体，IgM和IgG抗体一般分别在感染的1周和2周后开始出现，IgA抗体出现虽更早于IgM，但其灵敏度太低[1]。IgM在感染3～4周达到峰值，可做为急性期感染的诊断指标;IgG出现较晚，但持续时间长，一般用于判断既往MP感染。IgM和IgG抗体同时检测，有利于提高诊断率[6]。以下为几种临床常用的血清学检测方法。 2.1补体结合试验（CFA） 补体结合试验在10余年前是检测MP感染最常用的方法。MP感染后，MP抗原糖脂成分刺激机体产生特异性抗体。抗原抗体复合物和补体结合，在指示系统中能引起溶血;若血清中不含抗体，则补体不被结合，不发生溶血现象。但由于糖脂抗原并非MP的特异性抗原，与细菌、某些植物及人体组织可能有交叉反应，目前临床不常用。
2.2血清冷凝集试验（CAT） MP感染后，机体发生免疫应答，会产生一种非特异性IgM 冷凝集素。其在4℃下可使人的O型红细胞或自身红细胞发生凝集现象，而37℃温浴后凝集现象消失。当滴度≥64时，对MP感染有参考价值。该方法操作简单，但特异性较差，流感病毒感染、腺病毒感染、肿瘤等疾病也会导致CAT结果呈阳性，甚至抗生素的使用都会影响到CAT的结果[7]。
2.3酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA发明于1980年，常联合检测MP-IgM和MP-IgG以提高ELISA诊断率。原理是采用MP抗原包被于载体表面，捕获血清中的相应抗体形成免疫复合物，再与酶标记的第二抗体结合，借助酶的降解作用显示的颜色变化作出诊断[8]。该法仅需几个小时，且与其他常见的呼吸道病原体无交叉反应，目前已有多个品牌的ELISA 试剂盒在售。其缺点是需用双份不同时期的血清样本对患者确诊，且为多反应、多试剂、多步骤的检测方法，其中被板温育时间和温箱的温度、洗板次数、酶标仪的性能以及操作人员的熟练程度等多种因素均可影响检测的结果，易产生假阳性。
2.4胶体金免疫层析法（CGIA） 基于双抗夹心法，待测样本中的MP抗体先后与胶体金标记的抗原和层析膜上固定的捕获抗原结合，利用抗原抗体反应的特异性及胶体金的示踪放大效应，对MP抗体实现目视化检测[9];若层析膜上检测带区出现红色变色反应，结果为“阳性”[10]。该方法的结果只报告阴性或阳性，不能报告滴度。无需特殊设备，5～10 min得到结果，适宜在一般基层医院应用。由于其集合了免疫反应和色谱层析的优势，溶血、脂血、黄疽对结果均无影响，但特异性灵敏度不高，易造成漏诊[11]。
2.5颗粒凝集法（PA） 该法采用表面吸附MP抗原的明胶颗粒代替动物红细胞做载体，致敏明胶颗粒与血清中的MP 抗体发生凝集反应。目前应用的PA试验主要是利用乳胶和凝胶作为携带颗粒与试验血清进行孵育。如果血清中含有MP特异抗体，颗粒附着，产生可见反应。该法可显著消除血清冷凝集试验中动物红细胞的非特异性反应，凝集图像清晰[12]。PA试验应用混合MP抗原同时检测IgG和IgM。国内MP的检测主要采用进口试剂，如日本的PA（东京富士株式会社） 和美国EIA（GenBio公司）的MP抗体检测试剂盒，便是基于此法设计，3 h可出诊断结果，但这些试剂价格昂贵且存在抗原特异性问题。
3基因学检测
虽然MP血清学检测简便快捷，在临床上得到了广泛的应用。但这种方法仅对既往感染能提供较好的检测指标，而对现症感染考核的应用价值较低。临床上推荐将血清学检测和基因学检测同时进行以提高诊断准确度[13，14]。目前MP基因学检测的目标基因主要有三种：MP编码P1黏附蛋白基因、16S rRNA 和延伸因子Tu基因设计。
3.1核酸杂交技术 该技术根据两条互补的核酸单链可杂交结合成双链的原理，针对MP目标基因设计用放射性核素或化学发光试剂标记的核苷酸片段，通过杂交，可探知受检标本中有无与之互补的MP目的基因。美国GenProb公司的Gen-Prob rapid diagostic system诊断试剂，利用125I标记的cDNA探针，与MP特异的rRNA杂交，2 h内可完成检测。该方法与其他支原体DNA无交叉反应，但敏感性差，但采用放射性核素标记，不便于临床推广。
3.2聚合酶链反应（PCR）技术 PCR技术是一种模拟体内DNA复制的体外扩增技术，上世纪80年代开始被用于检测各种临床标本中的MP。该法具有灵敏度高和快捷等优点，检测标本中的MP不需要是活体，不受患者免疫功能、病程、感染程度和用药情况的影响[15]，可早期诊断MP感染。依靠核酸扩增技术对肺炎支原体进行筛查已经在各国广泛开展。PCR技术检测病原体的核酸， 不存在交叉反应和放射性污染，大大提高了检测的效率和灵敏性， 在临床上的应用已十分广泛。常用的PCR 法主要有常规PCR 法、巢式PCR[16]和实时荧光定量PCR（qPCR）[17]法等。而目前已报道的众多PCR方法中，绝大多数需要对PCR产物进行纯化、浓缩，这是一个即费时又费力的工作，很难满足未来对自动化的要求。此外核酸扩增技术检测过程中产生的假阳性污染也一直困扰着众多研发人员。qPCR作为其中的代表，巧妙利用了PCR技术扩增的高效性，探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及定量分析的优点，在完全闭管状态下进行扩增和产物分析，克服了普通PCR易污染不能定量灵敏度不高等不足，目前已有多種基于此技术的MP试剂盒应用于临床[1]，其检测时间更短，敏感性更高，不再需凝胶电泳分析检测结果[18]。但是也因其敏感性高，易使得MP定植时被误诊为感染。且存在荧光探针、仪器价格昂贵等问题[19]。
3.3环介导等温扩增法（LAMP） LAMP技术是一种新的核酸扩增方法，针对MP靶基因上的6个区域设计4条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，在65℃左右恒温条件下对靶序列进行高效、高特异性的扩增，可在15～60 min内实现109～1010倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物（焦磷酸镁白色沉淀），可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断MP靶基因是否存在[20]。不需进行模板热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等过程。LAMP方法最大优势就是高灵敏度外，操作简单，恒温装置就能实现反应，适合现场、基层快速检测的方法[15]。但由于LAMP 扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp内，大于500 bp则较难扩增，故不能进行长链DNA 扩增，检测对引物设计要求高。 4总结及展望
目前全球医疗决策中有2/3是基于诊断信息作出的，而诊断支出仅占医疗总支出的1%，诊断技术的进一步提高对疾病的预防、诊断和治疗具有积极意义。基于MP检测的庞大临床需求，特别是在“精准化医疗”被提到国家战略发展高度的社会大背景下，针对MP感染的实验室诊断方法也在不断更新发展，目前的MP检测方法很多，各有优缺点，尚且无统一的诊断标准。MP检测的方法主要有分离培养、血清学抗体检测和PCR诊断。MP分离培养耗时较长，且培养条件苛刻，灵敏度不高，用于临床诊断意义不大;目前临床有两类常用方法，一类是血清肺炎支原体抗体IgM（MP-IgM）检测，一类是肺炎支原体核酸（MP-DNA）检测。血清学检测简便快捷，在临床上得到了广泛的应用。但这种方法仅对既往感染能提供较好的检测指标，而对现症感染考核的应用价值较低。MP-DNA检测则可以弥补血清MP-IgM检测的不足，对于MP-DNA检测，检测标本中的MP不需要是活体，不受患者免疫功能、病程、感染程度和用药情况的影响，可以更早期地检测到MP的感染，有利于MP的早期诊断和抗生素的正确选择。目前，临床推荐在PCR法和血清学检测中各选择一种方法进行联合检测，尽快准确完成MP肺炎的诊断，以便及时、正确用药，减少并预防耐药性。
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收稿日期：2019-3-4;修回日期：2019-3-14
编辑/肖婷婷
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