宫颈上皮内瘤变及早期宫颈癌组织中P16、HPVL-1壳蛋白的表达分析

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　　[摘要] 目的 探討P16、HPV L-1壳蛋白的表达及在早期宫颈癌、宫颈上皮内瘤变中的筛查价值。 方法 本次研究纳入67例CIN患者及15例早期宫颈鳞状上皮细胞癌患者，另选取慢性宫颈炎患者31例，应用第二代杂交捕获法及免疫组化法检测HR-HPV载量、P16及HPV L-1壳蛋白表达并对相关性进行分析。 结果 P16蛋白在早期宫颈癌、HSIL、LSIL及慢性宫颈炎阳性表达率升高，HPV L-1壳蛋白阳性表达率有显著差异（P<0.05）。随着病毒载量不断增加，HPV L-1及P16蛋白阳性表达率均出现变化（P<0.05）。慢性宫颈炎P16蛋白表达阳性率及高危型HPV病毒呈正相关（P<0.05）。LSIL病变中P16蛋白表达阳性率与高危型HPV病毒呈正相关（P<0.05）。HSIL病变中P16蛋白表达阳性率与高危型HPV病毒无相关性（P>0.05）。 结论 P16、HPV L-1壳蛋白表达阳性在CIN及早期宫颈癌筛查中的应用价值较高。
　　[关键词] 宫颈上皮内瘤变;早期宫颈癌;P16蛋白;HPV L-1壳蛋白
　　[中图分类号] R737.33          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）21-0157-03
　　Expression analysis of P16 and HPV L-1 capsid proteins in cervical intraepithelial neoplasia and early cervical cancer
　　ZHAO Jian1   LIN Jun1   ZHOU Yan2   LIN Jing1
　　1.Department of Pathology， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou 324000， China; 2.Department of Gynecology， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou 324000， China
　　[Abstract] Objective To explore the expression of P16 and HPV L-1 capsid proteins and their screening value in early cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia. Methods This study included 67 patients with CIN， 15 patients with early cervical squamous cell carcinoma， and 31 patients with chronic cervicitis. The HR-HPV load， expression of P16 and HPV L-1 capsid protein were detected by the second generation hybrid capture method and immunohistochemistry. The second-generation hybrid capture method and immunohistochemical method were used to detect HR-HPV load and P16. And their correlation was analyzed. Results The positive expression rate of P16 protein in early cervical cancer， HSIL， LSIL and chronic cervicitis increased. The positive expression rate of HPV L-1 capsid protein was significantly different（P<0.05）. As the viral load continued to increase， the positive expression rates of HPV L-1 and P16 proteins all changed （P<0.05）. The positive rate of P16 protein expression in chronic cervicitis was positively correlated with high-risk HPV virus （P<0.05）. The positive rate of P16 protein expression in LSIL lesions was positively correlated with high-risk HPV virus （P<0.05）. The positive rate of P16 protein expression in HSIL lesions was not related to high-risk HPV virus （P>0.05）. Conclusion The positive expression of P16 and HPV L-1 capsid protein is of high value in CIN and early cervical cancer screening.
　　[Key words] Cervical intraepithelial neoplasia; Early cervical cancer; P16 protein; HPV L-1 capsid protein 　　宫颈癌在女性人群中有着较高的发病率，其发生率仅次于乳腺癌[1]。宫颈上皮内瘤变（CIN）、宫颈癌与人乳头瘤病毒（HPV）感染存在一定的关联。作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子，P16基因可对细胞周期发挥负调控作用，P16蛋白高表达会加大HR-HPV阳性宫颈上皮瘤变风险[2-3]。病毒早期复制阶段L1壳蛋白即可表达且可诱发宿主机体内产生免疫反应[4-5]。P16及HPV L-1壳蛋白在宫颈病变诊断中的应用价值较高，可为临床进行病情评估及制定针对性病情控制方案提供参考。本研究应用HC-2法及免疫组化法检测两种蛋白在宫颈病变、早期宫颈癌中的表达及HR-HPV病毒载量，对两者相互关系进行探讨和分析，本次研究对象均来自2016年3月～2018年7月我院确诊并接受治疗的患者临床资料，现报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　选取2016年3月～2018年7月在我院确诊并接受治疗的67例CIN患者和15例早期宫颈鳞状上皮细胞癌患者。其中，CINⅠ期29例，CINⅡ期15例，CINⅢ期23例，ⅠA1期7例，ⅠA2期8例。其中，LSIL组为低度鳞状上皮内瘤变患者（包括CINⅠ29例），HSIL组为高度鳞状上皮内瘤变患者（包括CINⅡ和CINⅢ共计38例）。随机抽取同期确诊并接受治疗的慢性宫颈炎患者31例作为对比组。纳入标准：所选患者病情均经宫颈活检等检查确诊;纳入对象具备正常的认知、沟通能力且均有性生活史。排除标准：有免疫抑制剂使用史者或合并免疫系统疾病者;注射过HPV疫苗者;处于哺乳期或妊娠期者;有宫颈手术史、放疗或化疗史者。CIN患者和早期宫颈鳞状上皮细胞癌患者基本临床资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
　　1.2 方法
　　1.2.1 试剂  购自凯杰生物技术有限责任公司第二代杂交捕获试剂盒、美国爱迪旺斯医疗科技有限责任公司Cytoreact HPV L-1 检测试剂盒、福州迈新生物技术有限公司的SP试剂盒、P16多克隆抗体试剂盒。
　　1.2.2 L-1殼蛋白检测[6]  应用原位杂交及免疫组化检测方式，严格按照试剂盒说明及步骤进行操作，准确识别组织切片上的28型宫颈癌 HPV L-1壳蛋白。HPV L1阳性：被红染细胞核数量超过1个。
　　1.2.3 P16检测[7]  应用免疫组化SP法进行检测，严格参考试剂盒说明书进行染色，阳性细胞：胞浆及细胞核可见褐色或棕黄色颗粒。40×10倍光镜下对病变细胞较多区域（10个视野）进行观察，计数100个细胞/视野，根据阳性细胞比例及分布情况判读，（-）：阳性细胞比例<5%;（+）：阳性细胞比例为5%～25%;（++）：阳性细胞比例为26%～50%;（+++）：阳性细胞比例>50%。
　　1.2.4 HPV病毒载量检测[8]  应用HC-2法进行检测，样本中HPV-DNA含量以每份检测样本中相对发光单位（RLU）/标准阳性对照临界值（CO）表示，可检测13种HR-HPV DNA病毒载量。RLU/CO≥1.0为阳性，根据HPV载量不同可分为以下几组：>1000 RLU/CO、>100～1000 RLU/CO、1～100 RLU/CO、<1 RLU/CO[2]。
　　1.3 统计学方法
　　应用SPSS19.0统计学软件包分析相关数据，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，符合正态分布的计量资料以（x±s） 表示，采用t检验，通过非参数Spearman 等级分析相关性，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 P16、HPV L-1壳蛋白在宫颈病变组织中阳性表达分析
　　分析P16、HPV L-1壳蛋白在早期宫颈癌、CIN及慢性宫颈炎组织中的表达P16阳性细胞主要分布于CIN组织病变细胞层中，染色深，随着CIN级别升高，P16阳性细胞颗粒增大、染色加深、分布区域加宽，表现为灶状或弥漫性分布。慢性宫颈炎组织中P16阳性细胞较为少见，底层细胞较为多见，主要表现为浅染色。不同宫颈病变组织中P16阳性率存在显著差异（P<0.05）。细胞核为HPV L-1壳蛋白主要存在区域，阳性细胞胞核内有红褐色颗粒，表层细胞有表达，基底细胞无表达。与其他各组相比，LSIL患者HPV L-1壳蛋白阳性率更高（P<0.05），见表1。
　　2.2 分析宫颈病变组织中P16、L-1壳蛋白表达及病毒载量分布情况
　　HSIL、LSIL及慢性宫颈炎等不同宫颈病变HR-HPV阳性率差异均有统计学意义，且随着宫颈病变级别增加，阳性检出率明显升高（P<0.05）。对于HSIL组及早期宫颈癌组HR-HPV阳性率差异不显著（P>0.05）。随着患者HR-HPV病毒载量增加，P16（++）及以上阳性表达率及L-1壳蛋白阳性表达率明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。不同组织学分级病毒载量分布差异有统计学意义（P<0.05）。宫颈癌患者及 HSIL患者主要表现为低病毒载量。见表2、3。
　　2.3分析HPV载量及P16、HPV L-1壳蛋白表达关系
　　随着慢性宫颈炎患者病毒载量升高，P16蛋白表达阳性表达明显增加，两者呈正相关（P<0.05）。LSIL患者HPV L1及P16壳蛋白表达与HPV载量存在相关性，P16与L1壳蛋白表达及病毒载量均呈正相关（P<0.05）。HSIL患者P16与HPV L1及壳蛋白表达与HPV载量无相关性（P>0.05），早期宫颈癌组织病毒载量与P16蛋白表达无相关性（P>0.05）。见表4。
　　3讨论
　　早期诊断宫颈癌前病变对于提高宫颈癌检出率、控制病情进展并改善其生活质量有重要价值[9]。CIN生物学行为并非单一进展，部分CIN可能自然消退或者持续不变，若不能准确判断患者病情，极易出现治疗不当或治疗过度等现象。因此，采用能够对CIN转归进行有效预测的客观指标对于评估患者病情及预后有重要价值[10-11]。 　　HR-HPV持续感染在宫颈癌发生及发展过程中发挥着非常重要的作用，但是，当前，HR-HPV病毒载量及CIN病变程度之间关系仍存在一定的争议[12-13]。有研究表明[14]，病毒载量临界值为15.00时，CINⅡ级及以上病变检测特异度低于50%，灵敏度高于90%，认为HR-HPV病毒载量与HSIL及宫颈癌发生风险呈正相关。本研究中，早期宫颈癌及HSIL组织均表现为低病毒载量。随着宫颈癌前病变级别增高，HR-HPV阳性率随之升高，与HSIL组患者相比，早期宫颈癌组织中HR-HPV阳性率相对较低，原因可能为本次研究纳入样本量较少。HPV病毒整合到宿主DNA后，宫颈病变癌变风险增加，病毒载量随之下降。病毒型别不同病变进展风险差异较为明显，病毒载量与致癌风险无相关性，目前尚无法单独通过病毒载量对病情发展情况进行预测[15-16]。
　　HPV病毒感染宿主细胞可分为两个阶段，分别为病毒复制阶段和病毒转化阶段，L-1壳蛋白在病毒复制阶段表达，可诱导机体生成HPV中和抗体，能够有效清除机体内病毒[17]。病毒DNA进入转化阶段，L-1壳蛋白表达缺失，宫颈局部免疫效应衰减，疾病进入进展阶段[18]。本次研究中，随病毒载量增加，L-1壳蛋白阳性表达率明显增加（P<0.05）。宫颈癌患者组织中L-1壳蛋白阳性率为0，LSIL患者中L-1壳蛋白阳性率为27.59%，此外，LSIL组患者P16蛋白阳性表达与L-1壳蛋白表达、病毒载量等均呈正相关，其他各组均无此种相关性，表明不同级别病变HPV病毒及宿主细胞之间免疫应答存在较大差异性，L-1壳蛋白可能为HPV病毒感染特定阶段特异性产物，表明L-1壳蛋白阳性患者病变进展风险较低，在临床预测CINⅠ疾病转归中的价值较高[19]。LSIL及慢性宫颈炎患者病毒载量与P16蛋白阳性表达呈正相关，LSIL患者L-1壳蛋白与P16蛋白表达呈负相关，随着病变级别升高相关性随之消失，表明在发病初期高病毒载量可对宫颈局部免疫应答产生刺激作用并对P16过表达产生诱发作用，机体免疫应答减弱导致疾病进展风险明显增加[20]。
　　综上所述，P16、HPV L-1壳蛋白表达阳性能够为临床筛查CIN及早期宫颈癌提供重要参考，可作为宫颈癌前病变重要观察指标。
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　　（收稿日期：2020-04-09）
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