MC4R和NR6A1基因与大白猪×清平猪F2黑色群体的经济性状关联分析

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　　摘要：选择MC4R和NR6A1基因分别对大白猪与清平猪杂交群体F2后代中黑色个体的胴体和生长进行关联性分析，以期为生产实践中对清平猪杂交品系的选育提供理论依据。结果表明，MC4R的优势基因为G等位基因，不同基因型明显影响背膘厚，AA型个体的平均日增重与AG型个体差异显著（P<0.05），与GG型个体差异极显著（P<0.01），其有利基因型为GG型;NR6A1的优势基因为A等位基因，不同基因型对背膘厚的影响差异明显，其对胴体和生长性状的有利基因分别为A和G等位基因。
　　关键词：清平猪;候选基因;胴体性状;生长性状;关联性分析
　　中图分类号：S828         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）05-0088-04
　　MC4R）属于跨膜G蛋白耦联受体（G-Protein Coupled Receptor，GPCRs）家族，是在下丘脑中合成的一种多肽类物质[1]。MC4R大量存在于中枢神经系统中，其与配体结合后通过G蛋白提高腺苷酸环化酶（Adenylyl cyclase，AC）的活性，再激活蛋白激酶（Protein kinase A，PKA）調控细胞内cAMP的浓度[2，3]。因此MC4R能调节动物的脂肪沉积与物质代谢，维持体内能量的动态平衡，在影响动物采食量、体重以及能量稳态方面发挥着重要的调控作用[1，4]。Kim等[3]首次报道猪MC4R基因高度保守区内发生了一个错义突变Asp298Asn，并指出该位点的多态性与背膘厚和生长速度有关。李星润等[1]对杜洛克、长白、大白共569头猪的MC4R基因进行了研究，结果表明在杜洛克和大白猪中对生长和胴体性状有利的基因型分别为GA型和AA型，而长白猪中不同基因型差异不显著。李庆岗等[5]研究发现淮猪新品系猪群中GG型与AA型相比，生长速度更快，活体背膘更薄。MC4R基因是公认的对猪生长和胴体性能有影响的主效基因之一，很多研究结果证明，猪MC4R基因的多态性与生长率、背膘厚和采食量呈强相关，是畜禽生长性状的重要候选基因之一[1，5-7]。
　　生殖细胞核因子（Nuclear receptor subfamily 6 group A member 1，NR6A1）属于核受体超家族，该家族是一组配体激活的，通过在信号分子与转录应答间建立联系的转录因子家族。NR6A1位于SSC1与椎骨数量变化相关的QTL区域，能调节细胞的生理过程，尤其是胚胎干细胞的生长和分化，影响生殖与神经系统的发育，与脂肪沉积、产仔数和猪的脊椎数等性状有关[8-10]。Rubin等[11]对猪的全基因组进行了测序，分析发现猪的体长性状和椎骨数目的变化与NR6A1、PLAG1和LCORL基因显著相关。Yang等[12]检测了3个西方猪种和7个中国猪种共519头猪NR6A1（c.575T>C）位点等位基因的频率，结果表明T等位基因在西方猪种中基本固定，中国猪种里岔黑猪中T等位基因频率达到0.585，他们推测里岔黑猪中可能引入了西方猪种的血液，且里岔黑猪较高的椎体数量（平均脊椎数为21.5个）与NR6A1基因的多态性有关。范家萌等[13]对东北民猪和荷包猪进行了NR6A1基因单核苷酸多态性检测，结果显示NR6A1基因与体尺性状相关，并指出其是调节民猪生长性状的功能基因。
　　清平猪是国家级保护目录品种，繁殖性能好，但其生长速度较外来猪种慢。目前黑色猪肉在市场上被认为是地方优质猪肉的一个显著标志。因此，期望利用分子标记早期辅助选择的手段，培育出兼具清平猪和外来猪种优良特性的毛色为纯黑清平猪新品系。对一些影响清平猪胴体与生长的关键基因进行关联分析，可以为后期高效利用分子标记早期辅助选择，加快培育出新清平猪品系奠定基础。
　　1  材料与方法
　　1.1  试验样品
　　所有的试验猪群均来自湖北省当阳市清平种猪场，其中F1为清平猪（♀）与法系大白猪（♂）的杂交后代，F2群体是F1群体横交后所选留的黑色个体。用于基因型频率分析的F2群体黑猪个体约600头。在全部黑色F2群体中，主要记录了219头雌性个体的眼肌面积和100 kg背膘厚等胴体性状，以及83头雌性个体的平均日增重和达100 kg日龄等生长性状。利用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，DNA 样品被稀释成50 ng/μL备用。
　　1.2  试验所需试剂
　　PCR扩增引物由奥科生物技术公司合成，引物详细信息见表1。Taq酶等分子生物学试剂购自TaKaRa。试验中常规试剂购自华中农业大学设备科。
　　1.3  MC4R基因G158A突变位点与NR6A1基因A200G突变位点的测序分型
　　根据候选基因测序引物信息（表1），交测序公司合成测序引物。以样品的全基因组DNA为模板，配制候选基因的PCR反应体系，进行PCR扩增。吸取10 μL样本送往武汉基诺赛克公司进行多态性测序，测序步骤包括：①首先使用捕获引物捕获各目标位点的DNA序列，然后回收产物并质检合格后依据Illumina文库构建流程完成Paired-end（PE）测序文库的构建。②取各个样本等量DNA构建一个PE文库并在Illumina Hiseq测序仪上进行PE150测序。③对于下机的原始数据，首先进行数据质控，得到高质量的cleandata，然后使用BWA软件将cleandata分解到各目标位点，得到SAM格式的比对结果，再使用软件samtools将SAM格式的文件转换成BAM格式，接着使用Picard工具中的SortSam对BAM文件中的reads进行排序，得到最终的BAM文件。最后，使用GATK确定各目标位点的基因型以及测序深度。
　　1.4  统计分析
　　利用Excel表格对候选基因进行基因型频率和基因频率的计算。不同基因型对繁殖性状值的最小二乘分析使用SAS（8.0版）的GLM（General linear model）软件包进行，关联分析的模型为Y=总体均值+基因型效应+残差，其中Y为性状表型值。加性效应=（XBB-XAA）/2，显性效应=XAB-（XAA+XBB）/2，其中XAA、XAB和XBB分别表示AA型个体、AB型个体和BB型个体对应的表型数据的平均值。用t检验进行显著性分析，确定有利基因和有利基因型。 　　2  结果与分析
　　2.1  候选基因多态性位点的基因和基因型频率的统计分析
　　候选基因的基因和基因型频率见表2，由表2可知，用测序方法共检测了1 257头F2群体的MC4R基因的多态性，其中F2黑猪318头，其3种基因型频率趋势均为AG>GG>AA，优势基因均为G等位基因;F2群体中NR6A1基因具有多态性，其A等位基因和G等位基因的基因频率分别为0.579 3和0.420 7，优势基因为A基因。
　　2.2  MC4R不同基因型与胴体性状的关联性分析
　　MC4R不同基因型与F2群体胴体性状的关联性分析结果如表3所示。MC4R基因的AA型个体和AG型个体的眼肌面积比GG型的分别高0.38 cm2和0.91 cm2，但是3种基因型之间差异不显著。MC4R不同基因型对100 kg背膘厚的影响为AA>AG>GG，加性效应为1.35 mm，且AA型个体与AG型和GG型个体差异均显著（P<0.05）。
　　2.3  MC4R不同基因型与生长性状的关联性分析
　　MC4R不同基因型与F2群体生长性状的关联性分析结果如表4所示。MC4R基因不同基因型对平均日增重的影响趋势为GG>AG>AA，GG型和AG型个体比AA型个体分别高0.06 kg和0.05 kg，且AA型个体和AG型个体差异显著（P<0.05），与GG型个体差异极显著（P<0.01）。3种基因型对达100 kg日龄的加性效应为2.61 d，其中GG型个体比AG型个体短4.1 d，3种基因型差异不显著。
　　这些结果表明MC4R GG基因型的背膘最薄，日增重最大，且不同基因型之间的差异明显，因此该基因的多态性位点可以作为F2群体选育的指标之一。
　　2.4  NR6A1不同基因型与胴体性状的关联性分析
　　NR6A1不同基因型与F2群体胴体性状的关联性分析结果如表5所示。NR6A1不同基因型对眼肌面积的影响趋势为AA>AG>GG，加性效应为0.19 cm2，3种基因型差异均不显著。NR6A1對100 kg背膘厚的影响为AA　　2.5  NR6A1不同基因型与生长性状的关联性分析
　　NR6A1不同基因型与F2群体生长性状的关联性分析结果如表6所示。NR6A1 3种基因型对平均日增重的影响为AG>GG>AA，AG型和GG型个体的平均日增重比AA型的分别高0.053 kg和0.037 kg，且AA型与GG型差异接近显著水平（P≈0.05）。NR6A1不同基因型对达100 kg日龄的影响为GG　　3  小结与讨论
　　MC4R不同基因型与背膘厚相关性的研究结果并不一致，本试验发现MC4R基因的GG型和AG型个体背膘厚比AA型平均薄2.70 mm和2.53 mm，二者均与AA型差异显著（P<0.05），与李庆岗等[5]对淮猪新品系的研究结果相符。MC4R基因对眼肌面积的影响为AG>AA>GG，差异不显著。结合文献报道，推测MC4R基因的GG型能降低背膘厚，从而提高胴体瘦肉率。目前对NR6A1基因多态性的研究主要集中于肋骨数、体长和体尺等性状[11，13]，对该基因与胴体性状的关联分析研究较少。本试验研究发现NR6A1基因的AA型比AG型和GG型的平均眼肌面积分别高0.22 cm2和1.18 cm2，平均背膘厚分别薄0.19 mm和2.25 mm，且3种基因型对背膘厚的影响差异明显，推测NR6A1基因的AA型个体可能具有更优良的胴体性能，即GG突变型个体对脊椎数等生长性状有利，但是可能与某些胴体性状负相关，这一结果与Huang等[14]在PIC猪上的发现相符。因此在进行清平猪杂交后代胴体性状的选育时，可以选择性淘汰部分NR6A1基因的GG型个体和MC4R基因的AA型个体，筛选出AA-GG（NR6A1-MC4R）个体，从而提高有利基因在群体中的频率。同时需要扩大胴体性状分析的样本容量，对候选基因继续进行验证，以确定其对群体的选育是否有准确的指导作用。
　　MC4R基因不同基因型对平均日增重的影响趋势为GG>AG>AA，3种基因型对达100 kg日龄的加性效应为2.61 d，推测MC4R对生长性状的有利基因为G等位基因，该基因可能能提高猪的生长速度，降低育种周期，这与李庆岗等[5]、韩雪蕾等[15]、肖石军等[16]的研究结果相符，表明MC4R基因对不同猪种的影响可能具有一致性，因此可以将其作为清平猪杂交群体生长性状选育的候选基因。
　　根据试验结果，对F2群体胴体和生长性能的选育工作提出如下建议：①NR6A1基因的AA野生型对胴体性能有利，但是大量文献报道其突变型GG与脊椎数正相关，因此需要针对具体的育种目标对群体的NR6A1基因进行选育。②MC4R基因对胴体和生长性状的有利基因均为G等位基因，因此在进行F2群体的选育时应保留GG型个体，从而在降低群体背膘厚的同时提高生长速度。
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