青蒿组织培养研究进展
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摘要 本文从外植体的选择与处理、培养条件和植物生长调节剂的种类及配比方面综述了影响青蒿组织培养的因素，并从外植体污染、褐变及玻璃化等方面分析了青蒿组织培养中存在的问题及对策，以期为青蒿组织培养快速繁殖提供科学依据。
关键词 青蒿;组织培养;影响因素;问题;对策
中图分类号 S567.219 文献标识码 A
文章编号 1007-5739（2019）17-0069-02 开放科学（资源服务）标识码（OSID）
Abstract This paper reviewed the influencing factors of tissue culture of Artemisia annua L.，from the aspects of the selection and treatment of explants，culture conditions，the types and proportions of plant growth regulators.The problems and countermeasures in the tissue culture of Artemisia annua were analyzed from the aspects of contamination，browning and vitrification of the explants，so as to provide scientific basis for the rapid propagation of Artemisia annua.
Key words Artemisia annua L.;tissue culture;influence factor;problem;countermeasure
青蒿（Artemisia annua L.）别名黄花蒿，是双子叶植物纲桔梗目菊科一年生草本植物。其茎高100～200 cm，根单生，叶纸质，多分枝;头状花序、形状为球形，总苞片层数为3～4层，两性花，数量为10～30朵，花颜色为深黄色;果实椭圆状卵形，略扁，瘦果小;花果期8—11月。作为我国传统的中药材，青蒿的作用有很多，主要作用是清热、凉血、化斑、消暑、泻热、消肿、止汗等;从中提取的青蒿素具有减慢心率、抑制心肌收缩力、抗心律失常、抑制肿瘤细胞生长等作用，对治疗疟疾也有着良好的疗效，并且低毒无副作用[1]。屠呦呦及其团队受到中医典籍《肘后备急方》的启发，在对中药进行大量研究的基础上创建了青蒿素提取方法，青蒿抗疟活性化学部位在1971年10月被发现，青蒿素在1972年11月被发现。因为发现了青蒿素，屠呦呦获得了2015年诺贝尔生理学或医学奖，2016年又获得了国家最高科学技术奖[2]。中国是世界上青蒿素原料药最大、质量最好的国家，仅重庆市酉阳地区的青蒿产量就约占全球产量的80%[3]。
大量、快速获取青蒿素含量高且稳定的青蒿的最好方法就是采用植物组织培养技术进行快繁，这也是提高青蒿素产量的有效途径之一。本文从外植体的选择与处理、青蒿的器官培养途径和组织培养中存在的问题对青蒿组织培养进行了概述，旨在为青蒿植物的组织培养快速繁殖技术提供科学依据。
1 影响青蒿植物组织培养的因素
1.1 外植体
1.1.1 外植体的选择。在植物组织培养研究中，外植体的选择是首要条件，若外植体取材方便、取材期长，那么在短期内就能得到大量再生植株，对迅速建立起无菌系进而达到产业化生产也有着极大的帮助。目前，用于青蒿组织培养的外植体有茎段、叶片、顶芽、花蕾、花枝和花序等部位。黄红芳等[1]曾用青蒿的茎段作为外植体进行组织培养试验，认为青蒿茎段为理想的外植体。王梦琼[4]用青蒿的花枝、花序和叶片作为外植体进行研究，得出了“愈伤组织的生成能力顺序为花枝>花序>叶片，植株再生以花枝的培养结果最佳”的结论。张丽珍等[3]用青蒿的幼叶作为外植体进行组培快繁试验，结果表明，青蒿的幼叶也可诱导出愈伤组织，诱导率达到87%。
1.1.2 外植体的灭菌。在接种之前必须对材料进行严格的灭菌消毒，否则植物组织培养无法顺利进行。灭菌消毒遵循的基本原则：要杀死附着在材料表面的微生物，同时还要保证材料不失去活性。要特别注意消毒时间，材料的不同决定了时间的不同。黄红芳等[1]在处理青蒿茎尖时，先用自来水冲洗30 min，然后用蒸馏水冲洗，再用吸水纸吸干表面水分后浸泡在浓度为75%的酒精中10 s，之后转入浓度为0.1%和0.2%的HgCl2溶液中浸泡10 min，其间搅拌2～3次，最后于超净工作台中用无菌水冲洗茎段3～4次。张丽珍等[3]在对青蒿顶芽进行处理时，将顶芽冲洗干净后放入超净工作台，用浓度为75%的酒精消毒30 s，再用浓度为0.1%的HgCl2消毒10 min，最后用无菌水冲洗顶芽3～5次。穆胜玉[5]在处理青蒿的花序时，先将花序放入浓度为10%的NaClO溶液中消毒15 min，然后用无菌水冲洗花序5次。李 飛等[6]在处理青蒿叶片与叶柄时，先将叶片和叶柄放在自来水下冲洗20 min，然后置于超净工作台上，用浓度为70%的酒精消毒10 s、0.1%升汞消毒8 min，之后用蒸馏水冲洗叶片和叶柄4～5次，最后用灭过菌的滤纸吸干叶片和叶柄表面的水分。王梦琼[4，7]在对试验材料进行处理时，先用浓度为70%的酒精浸泡1 min，再用浓度为5%的NaClO消毒10 min。刘春朝[8]在处理不同的外植体时用的方法不同，处理青蒿枝条时，先将枝条放在浓度为70%的酒精中消毒30 s，再用浓度为0.1%的升汞加入2滴吐温-80消毒7 min，最后用无菌水冲洗6遍;处理青蒿叶片和花蕾时，先用浓度为70%的酒精消毒30 s，然后用浓度为0.1%的升汞消毒5 min，最后用无菌水冲洗6～8次。综上所述，青蒿外植体灭菌过程相对简单，但分化率很高。 1.2 培养条件
温度、光照时间和光照强度等因素均对青蒿组织培养的效果有一定影响。一般来说，青蒿适宜的培养条件为温度（25±1）℃[3，5-6，8-9]或（25±2）℃[1，6]、光照12 h·d-1[1，6，8]或14 h·d-1[3]或16 h·d-1[5，9]、光照强度1 500 lx[1]或2 000 lx[3，5-6，9]。研究表明，外植体在培养初期，尤其是在诱导愈伤组织阶段，黑暗条件或弱光条件下培养效果较强光条件下更好[10]。王梦琼等[4，7]在诱导青蒿愈伤组织时，将材料放置在24～28 ℃条件下避光培养9 d。
1.3 植物生长调节剂
1.3.1 植物生长调节剂对青蒿愈伤组织诱导的影响。植物生长调节剂种类、浓度及其配比对青蒿愈伤组织诱导率具有一定影响。黄红芳等[1]用6-BA和IBA诱导青蒿茎段愈伤组织，在6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L时愈伤组织诱导率最高，达到100%。张丽珍等[3]用相同的生长调节剂诱导青蒿叶片愈伤组织，在6-BA 0.5 mg/L+IBA 2.0 mg/L时愈伤组织诱导率为60%。王梦琼[4]用6-BA和2，4-D诱导青蒿花枝与花序的愈伤组织，在6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L时诱导率达到100%。刘春朝[8]用6-BA和NAA诱导青蒿花蕾愈伤组织时，在6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L時诱导率仅有46.4%。穆胜玉等[9]用NAA和2，4-D诱导青蒿花序愈伤组织时，在NAA 1.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L时诱导率仅为5.56%。
1.3.2 植物生长调节剂对青蒿无菌苗生根培养的影响。张丽珍等[3]取2～3 cm高的青蒿再生苗接种至加入不同浓度IBA的1/2MS培养基中观察根的生长情况，结果发现，青蒿再生苗的生根诱导与激素浓度关系不大，不添加任何激素或者浓度较低的IBA也能诱导不定根的发生;最适合青蒿无菌苗生根诱导的IBA浓度为0.5 mg/L，诱导率达到93%。穆胜玉[5]在MS培养基中添加IAA和NAA进行青蒿生根培养试验，20 d后得出结论：对青蒿试管苗生根影响较大的是NAA的浓度，浓度越大，生根率越高，且根也明显增长、增粗;而IAA对于青蒿试管苗生根影响不明显，且IAA浓度增大生根率反而降低。李 飞等[6]将分化的丛生苗分别接种于1/2MS+1.0 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L NAA、MS+0.1 mg/L NAA等3种生根培养基上，发现青蒿幼苗在1/2MS+1.0 mg/L NAA生根培养基上根长得最长、最快，并且根粗壮且密，生长优势明显高于其他2个生根培养基。刘春朝[8]将不同外植体诱导的丛生芽接种在生根培养基中进行生根培养，结果表明，NAA和IBA即使浓度低，也均能成功地诱导丛生芽生根，生根率可达到80%以上。
2 移栽
组培苗根长1～2 cm时即可进行驯化移栽。移栽前先要进行开瓶炼苗，炼苗结束后将根上的培养基清洗干净，然后移栽至基质中。在移栽初期，为了使小苗适应外界的环境，应提供充足的光照和适宜的空气湿度;在移栽后期，注意勿过旱或过涝。李 飞等[6]将已经生根的青蒿闭光炼苗5～7 d后栽种到珍珠岩和草木灰按2∶1的比例配制的基质中，移栽成活率可达到90%。刘春朝[8]将根长5 cm左右的幼苗在培养室中打开瓶口炼苗3～5 d后移栽于蛭石和营养土比例为1∶1的混合基质中，成活率达到90%以上。
3 青蒿组织培养中存在的问题及对策
3.1 外植体污染及其防治
污染是指在植物组织培养过程中，由于细菌、真菌等微生物的侵染，在培养容器中滋生出大量的菌斑，导致培养材料不能正常生长和发育的现象[11]。外植体污染的形式有很多种，主要分为真菌污染和细菌污染。真菌污染是由霉菌和酵母菌引起的，特点是易于发现，但是污染速度快、控制困难，一旦发生真菌污染则损失较大;细菌污染是由各种细菌及内生菌引起的，特点是潜伏期较长，有时继代几次后才能够表现出来[12]。污染的原因多种多样，如外植体带入、培养基高压灭菌不到位、培养室灭菌不彻底、操作污染等;在后期培养过程中，由于人员经常出入，也会造成污染发生。控制外植体污染的措施包括组培室消毒、外植体消毒、对真菌的控制、对细菌的控制等。
3.2 褐变及其防治
褐变是指在离体繁殖过程中培养材料向培养基中释放褐色物质，导致培养基颜色由无色变为褐色，培养材料也随之死亡的现象[13]。褐变在植物组织培养过程中很常见，主要起决定作用的是植物多酚氧化酶（PPO）。一般情况下，若氧气存在于培养基中，酚类化合物就能在PPO的催化作用下转化为醌，醌再进行聚合反应形成黑色素，从而导致褐变的发生[14]。贾秀山等[15]认为，对于青蒿叶片和茎段诱导而言，叶片诱导分化培养的褐变较少，茎段诱导分化培养褐化较严重，可能是因为叶片诱导愈伤组织的PPO活性较低。PPO的活性和总酚含量的变化规律决定了外植体褐变的变化规律，起决定性作用的是酚类物质的含量。控制褐变现象的措施包括合理取材、母株和外植体预处理、选择合适的培养基和外植体的连续转移等。
3.3 玻璃化及其防治
玻璃化是植物组织培养中一种独特的生理现象，是由于培养环境中一些物理、化学和生化因素共同作用，导致植物组织代谢紊乱所致。有玻璃化现象的植株也被称为“玻璃苗”，其往往呈半透明状，如同玻璃。玻璃苗在青蒿组织培养过程中非常常见。玻璃苗由于生理功能不同于正常苗，所以很难移栽成活。影响玻璃苗发生的因素有很多，如外植体的类型、培养基的种类与浓度、激素的质量浓度及配比、琼脂的浓度、蔗糖的浓度以及温度、光照等[16]。解决青蒿组培苗的玻璃化现象不能只采取一种处理方式。张丽珍等[17]发现，在MS培养基中添加1.0 mg/L 6-BA、4%蔗糖、0.75%琼脂和0.08%碳粉，能够使增殖系数增高、玻璃化率降低。刘春朝[8]在试验中发现，顶芽和茎段等外植体诱导出的丛生芽玻璃化现象比较严重，在顶芽和茎段的培养中，防止玻璃化现象发生的最好方法是增加培养基中蔗糖和琼脂的浓度，在MS培养基中附加50 g/L的蔗糖或9 g/L的琼脂能有效防止组织培养中出现的玻璃化现象。 4 参考文献
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