凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验的改进
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摘要：为了解决实验教学中存在的一些实际问题，本文对凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜实验进行了改进，给出一套简单、操作方便、实验结果可靠且重复性好的实验方案，使得该实验得以在本科教学中开展。本实验的设计符合了本科生实验教学特点，为农业类院校生物化学专业基础课提供一个典型实验，同时降低了实验成本。本实验不仅适用于本科生，同时也适用于研究生进行科研素质训练，以达到掌握实验原理与实验方法，初步掌握凝胶过滤分离技术。
关键词：凝胶过虑；实验教学；血红蛋白；硫酸铜
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2019）23-0273-02
分离和提纯蛋白质方法多种多样，其中最为重要的一种方法就是凝胶过滤层析。凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法，是一种有效的液相层析色谱技术，具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子的生物学活性等优点，目前已广泛应用于各种生物大分子物质的分离和純化[1]。作为一项基本的实验技能，在农业类院校已经把凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜作为生物化学教学的一项基本实验[2]。凝胶层析技术不仅被广泛应用于科研与教学，同时也是医学和生物技术类院校普遍安排的对本科生和研究生的生化实验[3，4]。通过凝胶过滤分离血红蛋白与硫酸铜，让学生充分了解凝胶过滤层析的工作原理、方法及应用等，初步掌握凝胶过滤分离技术。但由于实验过程步骤复杂、耗时过长，或者实验结果不理想，再加上仪器、试剂、样品处理等原因的约束，而使其在本科生实验教学中很难开设。为了能让学生在两个学时内完成实验过程并且能掌握实验原理与实验的方法，我们进行了多次的预习实验，最后确定了一套实验方法与步骤，简化了实验过程，充分利用了试剂，对样品也进行了一些改进，在实验过程中使用直径为1cm、长为15cm的层析柱。利用较少的样品、简便的器材即可以完成操作，使其适合在本科生实验教学中开设[5]。现将整个实验方案介绍如下。
一、实验原理
凝胶过滤的方法广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐等。凝胶是一种有立体网状结构的不溶性珠状颗粒物质，用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子具有不同的排阻效应进行分离。把样品加到充满凝胶颗粒的层析柱中用缓冲液洗脱，当被分离的混合物溶液通过凝胶的网孔向下运动时，由于大分子物质直径大于凝胶的网孔，不能进入胶粒内部而完全被排阻在外，沿着胶颗粒间的缝隙向下移动，所以大分子物质流程短、流速快，首先流出柱外。而一些小分子物质由于直径小于凝胶的网孔，不被排阻，可以自由扩散，进入凝胶的颗粒内部，而后又被经过的洗脱液带走。由于其不断地进入和流出凝胶颗粒，使其流程变长、移动速度变慢，小分子物质反而最后流出层析柱。这样就使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。凝胶过滤层析又称之为排阻层析[1]（如Sephadex G-50），是一种按照分子量大小分离物质的层析方法[6]。
二、器材和试剂
（一）器材
层析柱、移液管、洗耳球、试管与试管架、分光光度计、血红蛋白与硫酸铜、Sephadex G-50等。
（二）试剂
洗脱液：0.05mol/L磷酸缓冲液
血红蛋白溶液：称取2g血红蛋白加入10mL蒸馏水中充分溶解。血红蛋白溶液使用前要进行离心，以彻底清除杂质，保护柱床以及保证分离的效果。
碱性硫酸铜溶液：将硫酸铜3.73g溶于10mL热蒸馏水中，冷却后稀释到15mL。另取柠檬酸钠17.3g及Na2CO3·H2O 10g加水60mL，加热使之溶解。冷却，稀释至85mL。最后把硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，混匀即可[6]。
血红蛋白-碱性硫酸铜混合溶液：在临使用前将上述血红蛋白溶液和碱性硫酸铜溶液按体积比1∶1混合待用。
三、操作步骤
凝胶预处理（提前由实验员完成）：称取葡萄糖凝胶Sephadex G-50适量（视装层析柱数量而定）于烧杯中，加人足量的蒸馏水或洗脱液于沸水浴中溶胀5小时或室温溶胀过夜；待溶胀平衡后，用玻璃棒适度搅拌使之充分悬浮后静置，等大部分凝胶沉降后，慢慢倾倒去掉漂浮在上层的细小颗粒；如此反复倾倒几次直到清除干净悬浮的细小颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，准备装柱[6，7]。
1.装柱。层析柱下端止水，倒入洗脱液，排除气泡，将底部留少许洗脱液。把溶胀好的凝胶边搅拌边倒入柱中，当底部沉积约2cm凝胶时，打开下端出口开关，让洗脱液缓缓流出。注意装柱过程中层析柱下端需要适时止水，以保证洗脱液面始终高于凝胶面1cm左右，防止凝胶因脱水而毁柱。待肉眼可见的凝胶沉降至8cm时为止。
2.清洗与柱平衡。检查柱床是否均匀，若有气泡或分层界面，或者残留物时，需要重新装柱或清洗。此时将装好的层析柱倒入洗脱液，使洗脱液高于柱床面3—4cm，然后用拇指压住层析柱管口，水平晃动层析柱，使柱内葡聚糖完全悬浮；然后竖直使其自然沉降后，把多余的洗脱液从底部排出，使层析柱床平衡5分钟；然后沿着柱壁环绕加入1—2倍洗脱液清洗平衡层析柱，打开下端出口使柱内洗脱液不断流出；最后待液面与凝胶床表面平齐时（注：整个清洗平衡过程中不可使凝胶表面干燥），关闭出口，停止洗脱。在平衡过程中调节好流速和收集器械，待平衡完成后即可使用。
3.加样与洗脱。吸取0.2ml样品距柱床表面1mm处沿管壁轻轻转动加入样品，然后打开底端出口开关，使样品浸入床表面，用少量的洗脱液同样小心清洗表面样品1到2次，使洗脱液流至床表面，以尽量避免样品的稀释以保证分离效果；然后用滴管小心加人洗脱液约高于柱床面4cm，调节好流速开始连续洗脱收集。在加样和洗涤过程中防止冲坏柱床面。
4.收集与测定。打开出口，收集洗脱液，每1.5mL收集一管，共计5—10管。在451nm波长处以洗脱液为空白对照进行光吸收测定，测定后以收集管数为横坐标，光密度为纵坐标对应作曲线图。
四、结束语
本实验在进行装柱的过程中要连续装柱，才能保证胶柱的均匀。装柱的过程中还要一直保持胶体处于洗脱液中，避免干胶。在平衡过程中要调节好流速，以利于收集。流速会影响分离的效果，太慢了峰值趋缓，太快了可能导致分离不彻底，蛋白峰与盐峰重叠[7]。流速的调节根据具体情况而定，每分钟10滴为宜，一管收集18—20滴。
预先对层析柱的规格进行了筛选，直径为1cm、长为15cm的层析柱是最好选择。对加样量进行了优化，0.2mL的加样量刚好能满足实验的要求，达到比较理想的分离效果。对于血红蛋白与硫酸铜实验来说，Sephadex G-50分离效果最好。为了更精确的测量光密度值，用5mm规格的比色皿，增加接收管数，做出更准确的曲线图。
在本科生教学中开展，建议2—3人一组进行实验，该实验已经在20多个本科专业开设，实验学生人数达一万余人次。
参考文献：
[1]史伟，禹婷.蛋白质的层析分离[J].内蒙古农业科技，2011，（01）：110-112.
[2]刘明，晁代军，王淑娟.凝胶层析分离蛋白质的实验改进[J].哈尔滨医科大学学报，2000，（05）：315.
[3]袁榴娣.生物化学实验指导[M].第一版.南京：东南大学出版社，2007：68-70.
[4]杨歌德，姜玉梅，周宏博.凝胶层析分离蛋白质实验中3种过滤介质分离效果的比较[J].哈尔滨医科大学学报，2002，（3）：242-243.
[5]薛金艳，李俏俏，王云飞，王爱民.凝胶层析分离蛋白质实验方法的优化[J].哈尔滨医科大学学报，2010，44（06）：627-628.
[6]高玲，刘卫群.生物化学实验教程[M].北京：高等教育出版社，2010
[7]李翠蓉.凝胶层析脱盐技术应用[J].石河子科技，2009，（06）：43-45.
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