不同产区晾晒烟资源多样性的鉴定与评价

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　　摘  要：为提高我国晾晒烟资源利用效率，开发其新的用途，对来源于黄淮、西南、东南、东北、长江中上游等5个产区的93份晾晒烟种质进行了农艺性状调查、化学成分测定以及遗传多样性分析。结果表明，不同种质农艺性状及化学成分含量差异较大。不同性状变异系数在7.60%～70.17%，其中，生育期的变异系数最小，总氯的变异系数最大。烟碱含量在1.20%～8.63%，钾含量在0.91%～4.18%。从580对SSR引物中筛选出43对扩增清晰、重复性和多态性好的引物，共扩增获得多态性条带146个，多态性比例97.99%，Shannon’s指数为0.9379，Nei’s多样性指数为0.5356。聚类分析表明，在相似系数0.50处可将93份晾晒烟种质分为3类。东南烟区群体与黄淮烟区群体遗传相似系数最大，为0.9580，而西南烟区群体与东北烟区群体遗传相似系数最小，为0.7820。因此，93份晾晒烟种质农艺性状、化学成分以及分子遗传多样性丰富，可为晾晒烟资源新用途的开发和利用提供物质基础和理论支持。
　　关键词：晾晒烟;农艺性状;化学成分;SSR分子标记
　　中图分类号：S572.03          文章编号：1007-5119（2019）02-0008-08      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.02.002
　　Abstract： In order to improve the utilization efficiency and to develop new utilization approaches of air/sun-cured tobacco germplasm resources， we conducted agronomic trait characterization， chemical composition determination and genetic diversity analyses using 93 air/sun-cured tobacco germplasms grown in five tobacco cultivation areas in China. The results showed that the agronomic traits and chemical components of different germplasms varied greatly. The coefficient of variation ranged from 7.60% to 70.17% in different traits. The coefficient of variation of the growth period is the smallest， and that of the total chlorine is the largest. The nicotine content ranged from 1.20% to 8.63%， and potassium content ranged from 0.91% to 4.18%. In addition， 43 pairs of primers with specific amplification were screened from 580 pairs of SSR primers， and 146 polymorphic bands were obtained， of which the polymorphic ratio was 97.99%. The Shannon's index was 0.9379， Nei's diversity index was 0.5356. The 93 tobacco germplasms were clustered into 3 groups with the genetic similarity coefficient of 0.50 by cluster analysis. Germplasms from different cultivation areas in many cases were not clustered  together. The genetic consistency between the population in the southwest cultivation area and the Huanghuai cultivation area was 0.9580， while the genetic consistency between the southwest cultivation area and the northeast cultivation area was 0.7820. These results will provide reference for screening and matching the parental germplasms for breeding of excellent mixed cigarette and oral tobacco.
　　Keywords： air/sun-cured tobacco; agronomic traits; chemical composition; SSR molecular marker
　　晾曬烟是指在阴凉通风处晾制或利用阳光调制而成的烟叶，主要有浅色晾烟和深色晾烟及晒红烟和晒黄烟之分[1]。晾晒烟的外观特征及化学品质与烤烟类似，但含糖量较低，且烟碱含量及蛋白质含量较高，烟味浓，劲头大[1-2]。有研究认为，在烤烟型卷烟中添加晾晒烟叶能有效降低焦油及CO含量，增加卷烟浓度、香气丰富性、透发性及甜润感[2]。在混合型卷烟中使用适量的晒黄烟，能减弱其生理强度和刺激性，使其吃味醇和，香气浓郁，味香色更加协调。由于晾晒烟叶的含糖量低于烤烟且组织疏松，燃烧性好，使其焦油释放量低于烤烟，因此可以较好地控制焦油含量[3-4]。鉴于晾晒烟的优异特点，还可作为口含烟的主要烟叶原料。口含烟属于新型烟草中无烟气烟草的一种，瑞典和美国则是主要消费市场，瑞典式口含烟的原料是来源于世界各地的晾晒烟叶，美式口含烟主要采用深色明火烤烟及深色晾烟为原料[5]，由此可知口含烟最主要的烟叶原料便是晾晒烟。我国保存有晒晾烟资源共2000余份，且分布广泛，香味风格各异，不仅为优质的混合型卷烟提供了原料，同时也为筛选适合我国口含烟原料的优质种质提供了丰富的物质基础。 　　目前晾晒烟的研究主要集中在亲缘关系鉴定、农艺性状遗传以及栽培调制等方面。张雪廷等[6]利用云南省烟草研究院开发的3000多对SSR引物对38份晾晒烟种质进行亲缘关系分析，证明SSR分子标记对晒烟种质亲缘关系的鉴定具有可行性。刘艳华等[7]利用SSR分子标记的方法对新收集的26份晒黄烟与种质库6份资源进行了遗传多样性分析，为晒黄烟资源的高效利用奠定了基础。戴培刚等[8]利用8个晾晒烟种质配制完全双列杂交，并对其6个主要农艺性状进行遗传分析，结果表明多数农艺性状以加性效应和显性效应为主，各效应在不同农艺性状中所占的比例不同，为晒晾烟农艺性状的改良提供了理论依据。但晾晒烟应用范围相较烤烟并不广泛，对于优质晾晒烟种质的选择缺乏合理的指导，本研究筛选了来源于不同产区的93份晾晒烟种质进行适应性和多样性的鉴定与评价，以期为晾晒烟资源的高效利用，优质混合型卷烟和新型烟草制品原料筛选以及新品种培育提供物质基础和理论指导。
　　1  材料与方法
　　1.1  试验材料
　　从2000余份晾晒烟中随机筛选出原产地分别为山东、湖南、贵州、四川、吉林等15个省的种质共93份，根据产区分为东北烟区（Population 1）、黄淮烟区（Population 2）、长江中上游烟区（Population 3）、东南烟区（Population 4）以及西南烟区（Population 5）等5个群体（表1）。
　　1.2  试验方法
　　1.2.1  农艺性状调查  试验于2016、2017年在山东临沂沂水县高庄镇进行，选择肥力均匀、地力条件一致的田块，93个品种，编号为S1—S93，田间种植顺序排列，两边分别种植4行NC89为保护行，试验材料在田间顺序排列，每个品种种植3行共60株，株行距110 cm×50 cm。田间管理和调制按当地统一模式进行。在第一青果期，每个品种每行选择有代表性的5株、3行共15株，按照《烟草种质资源描述规范和数据标准》[9]进行农艺性状调查。
　　1.2.2  化学成分测定  取调制后的中部烟叶样品，磨粉，并利用Aataris II FT-NIR 光谱仪（Thermo Fisher 公司）进行近红外化学成分检测。
　　1.2.3  DNA提取与PCR扩增  以每份种质的嫩叶为材料，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，利用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。试验所用SSR引物来自BINDLER等[10]及TONG等[11-12]开发的引物，由上海生物工程有限公司合成。
　　PCR总反应体系为10 μL，其中模板DNA 1.5 μL，2×Dream Taq Green PCR Master Mix 5 μL，正反向引物各0.5 μL，ddH2O 2.5 μL。扩增反应在T100? Thermal Cycler上进行，扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶上对扩增产物恒电压150 V电泳1.5 h。用改进的NaOH银染方法进行染色显影。
　　1.2.4  数据统计  利用Excel计算农艺性状和化学成分含量的平均值、极差、标准差及变异系数。
　　将电泳图谱中扩增产物在同一位置的条带赋值为1，弱带或缺失的赋值为0，形成1、0数据矩阵。根据NEI等[13]和SHANNON等[14]的方法，以PopGene32软件[15]在假定哈丁-温伯格平衡条件下计算Shannon指数的估计值，同时计算群体内遗传一致度和群体间遗传距离，并利用NTSYS2.11软件[16]以UPGMA法进行聚类分析。
　　2  结  果
　　2.1  农艺性状分析
　　对93份晾晒烟种质资源农艺性状进行调查、
　　分析（表2），兩年试验结果表明，93份晾晒烟品种间主要农艺性状变异丰富，变异系数范围为7.60%～44.27%。除产量以外，其他农艺性状2017年平均值均高于2016年，但年度间的变异系数差异不显著。其中，生育期变异系数最小，为7.60%～8.04%，表明各种质资源生态适应性较强，在山东烟草生育期间均可成熟采收。产量变异系数最大，为38.54%～44.27%，范围在255.41～2310 kg/hm2。其次是叶数，为28.92%～29.57%，范围为8.78～40.4片/株。另外，2016年株高大于170 cm的有8份种质，其中S75、S82、S22在2017年株高表现也较高。叶数大于30的有8份种质，其中S27叶数最多，高达37～40;S1、S2两份种质叶数均低于10。
　　2.2  化学成分含量分析
　　由表3可以看出，2017年烟叶平均钾、总氮以及总糖含量低于2016年平均值，而烟碱、挥发碱和氯含量高于2016年平均值，但两年间变异系数差异不显著。化学成分整体变异系数范围在13.34%～70.17%之间，变异丰富。其中总氯变异系数最高，为69.15%～70.17%，在相同环境和土壤条件下，品种间差异高达30.02倍。总氯含量在两年中表现均高于1.8%的有S10，S11以及S12;而S23、S35、S76以及S83含氯量则低于0.3%，且表现稳定。总氮和挥发碱的变异系数最小，分别为13.34%～14.45%、18.05%～20.49%。此外，烟碱和总糖含量在不同种质间也存在较大差异，范围分别为1.20%～8.63%、1.34%～7.84%。93份晒烟种质平均烟碱、总糖含量分别为5.3%～5.5%、2.94%～3.04%，其中两年烟碱含量高于4.5%的种质几乎占50%。总糖在两年表现均低于2%的种质有S5、S10、S19、S55以及S78，且所有低糖含量种质的烟碱含量均高于4.5%，其中S5、S10、S19烟碱含量均大于7%。 　　2.3  遗传多样性分析
　　2.3.1  多态性SSR引物筛选  从93份种质中选取来自不同产地的12份材料进行引物筛选，从580对引物中筛选出43对条带清晰且多态性好的SSR引物。利用这43对引物对93份晾晒烟种质资源进行多态性扩增，共获得146个多态性条带，多态性比率为97.99%（图1）。
　　2.3.2  群体内遗传多样性分析  根据原产地将93份种质资源分为5个群体。群体1包括原产于吉林、辽宁、黑龙江的16份种质，群体2包括原产于河南、山东的10份种质，群体3包括原产于湖南的33份种质，群体4包括原产于广东、江苏、浙江等省份的10份种质，群体5包括原产于贵州、云南和四川的24份种质。群体内遗传多样性分析（表4）表明，群体3的遗传多样性指数为0.5359，其遗传多样性最高，向下依次是群体1、群体2和群体4，遗传多样性指数分别为0.5150、0.4804和0.4677。群体5的遗传多样性最小为0.4492。
　　2.3.3  群体间遗传多样性分析  利用PopGene32 软件对5个群体的遗传相似性进行计算（表5）。群体2和群体4的遗传相似性系数最高，为0.9580，遗传距离最近，为0.0429。群体2与群体5遗传相似系数次之，为0.8884。群体1与群体5遗传相似系数最小，为0.7820，遗传距离最远，为0.2460。
　　2.3.4  聚类分析  聚类分析结果表明（图2），93份晾晒烟种质的遗传相似性系数在0.50～0.94之间。在相似系数为0.50时，可将93份种质材料分成3大类群，第1类群有S2、S4、S17、S18、S67、S3、S81、S86、S6、S7、S19共11份种质，这些种质全部来自于吉林、黑龙江等东北地区及山东地区。第2类群包括S35、S53、S43、S74、S82、S83、S84、S88、S93、S64、S71、S65共12份种质，这些种质分别来自5个产区。第3类群包括两个亚类，共70份种质，其中第一个亚类有S23、S87、S70共3份种质，其中S23和S87来自黄淮烟区，S70来自东南烟区;第2亚类包括来源于5个产区的67份种质。另外，SSR引物PT30215和PT20286可将同名种质S82、S83、S84、S85、S87、S92区分开，其中分别来自安徽和辽宁的S82、S83遗传距离最近;而来自山东的S92与其他同名资源遗传距离最远。
　　3  讨  论
　　3.1  晾晒烟农艺性状评价
　　烟草品种的农艺性状、产量以及适应性鉴定是优异种质筛选和优良品种选育的必要程序。雷丽萍等[17]对12份云南晒烟品种进行外观质量评价和化学成分分析，筛选出了综合性状较好的Virginia 309、朝刀烟和Virginia 331 三个品种。刘岱松等[18]对32份晒晾烟种质的农艺性状和化学成分数据进行聚类分析，筛选出综合性状优良的湖南宁乡晒烟、公会晒黄烟（深色）、公会晒黄烟。本研究对93份晾晒烟种质进行了适应性和农艺性状鉴定与评价，发现来自不同产区的晾晒烟种质适应性较强，在山东均能正常成熟;叶数、产量等农艺性状变异范围广泛，其中叶数大于30的种质占10.26%，供试种质叶数较多可能与测量参考标准有关，生产上品种叶数是指打顶后的有效叶数量，一般比按《烟草种质资源描述规范和数据标准》测定的每株叶数少5片左右。S27、S82、S53等可作为多叶型材料进行利用;另外，虽然S1、S4叶数较少，但其生育期短，在生产和生物学研究中可作为早熟遗传材料加以利用。而对于产量中等或高产种质，可结合其化学成分进行综合评价。
　　3.2  晾晒烟化学成分评价
　　化学成分是影响烟叶品质的重要因素，其含量及其协调性决定了烟叶的质量。王允白等[19]研究表明，糖碱比与香气、吃味、杂气及评吸总分呈极显著（显著）正相关，而与刺激性呈极显著负相关。于建军等[20]对会理烟区的烟叶分析表明，烟叶钾含量对香气质、香气量以及评吸总分均有较大的正面影響，而氯含量则对这3个评吸指标有较大的负面影响。本研究对93份晾晒烟资源化学成分鉴定表明，烟碱含量范围为1.20%～8.63%，平均为5.30%～5.50%，远高于我国烤烟烟碱含量[21];总糖含量范围1.34%～7.84%，平均为2.94%～3.04%，远低于我国烤烟总糖含量，研究结果与杨春元等[22]、何川生等[23]的结果一致，但变异范围更大。另外，93份晾晒烟资源氯含量变异系数最高，钾含量大于3%的种质占供试资源的四分之一。其中高烟碱低糖、高钾种质可为口含烟原料和低焦油种质的筛选和新品种培育提供丰富的物质基础。
　　3.3  基于SSR分子标记的多样性分析
　　对烟草种质进行农艺性状及化学成分鉴定是资源鉴定中的必要步骤，但利用表型鉴定进行种质筛选仍存在一定的局限性。随着烟草SSR分子标记技术的发展，利用SSR分子标记进行种质资源的遗传多样性和亲缘关系的分析得到了广泛的应用。叶兰钦等[24]利用SSR分子标记研究了云南烟区13个烟草主栽品种的遗传多样性。徐军等[25]利用8对SSR引物可将80份烟草种质完全区分开。本研究聚类结果显示，93份种质之间遗传相似系数在0.50～0.94之间，遗传多样性大于王曼[26]和刘艳华等[7]的报道，表明本研究筛选的93份晒烟种质代表性更广泛，遗传多样性更丰富。而来自贵州的两份种质S11和S12遗传相似系数最高，为0.97，这可能是因为在特定的环境条件下，由于育种目标相同，选育种质遗传基础也趋于相同的缘故。
　　不同群体间遗传相似性结果表明，群体2和群体4遗传相似系数最大，群体1和群体5遗传相似系数最小;聚类分析结果亦表明，来自于黄淮烟区的S23、S87与来自于东南烟区的S70可聚在相同的亚类中，而来自西南烟区的S15与来自东北烟区的S19遗传距离较远。这可能是因为黄淮烟区和东南烟区地理位置最近，而东北烟区和西南烟区地理位置最远的缘故，因此，遗传相似性与地理位置存在一定的相关性。另外，一些来自不同产地的同名 　　种质S82、S83、S85及S92遗传差异却较大，这可能是因为不同产区引进了同一品种，根据育种目标的不同，经过长期的人为选择，在特定的地理環境条件下，造成遗传漂移或漂变，从而表现出一定的遗传差异[27]。另外，来自不同产区的S35、S74、S82、S71以及S88等12份烟草资源却聚为一类，这可能是由于产区间互相引种造成的，此结果与刘国祥等[28]的研究结果较一致。综上所述，利用SSR分子标记技术不仅可对晾晒烟种质资源进行遗传多样性分析，并且可对其亲缘关系以及同名异种资源进行鉴定。
　　4  结  论
　　研究结果表明，来自不同产区的晾晒烟资源生态适应性较强，在山东均能正常成熟采收。不同产区、种质间农艺性状、化学成分差异均较大，种质遗传基础较丰富。东北烟区晾晒烟资源在山东的株高表现最矮，茎围最细。东南烟区晾晒烟资源在山东平均生育期最长，株高最高，节距最短，单株平均叶数最多。其中来自东北烟区的S1、S2生育期最短，单株叶数最少，分别来自于长江中上游烟区和东南烟区的S27、S82单株叶片数最多，生育期最长。另外，东北烟区晾晒烟资源烟碱含量最高，西南烟区总糖含量最低，其他3个产区化学成分差异不显著，但种质间差异较大，其中S19调制后烟叶烟碱含量是S84的近8倍，S82糖含量是S55的7倍多，S73氧化钾含量是S34的3倍多。综合评价优异的有S3、S10、S19、S33、S66、S73、S82以及S84等8份晒晾烟资源，且他们的遗传距离相对较远，代表的遗传基础比较丰富。本研究结果可为晾晒烟资源产区间的引种、新品种培育以及新用途的开发提供理论依据和物质基础。
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