恩拉霉素人工抗原的合成与鉴定

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　　摘要：建立酶联免疫方法以检测食品中恩拉霉素的残留，采用戊二醛法，偶联半抗原恩拉霉素（Er）和载体牛血清白蛋白（BSA）或卵清白蛋白（OVA），制备人工免疫抗原和人工包被抗原，分别为Er-BSA和Er-OVA。经紫外光谱鉴定，在紫外270～280 nm波长处得到Er-BSA和Er-OVA特征性偶联吸收峰。试验结果表明人工合成的2个人工抗原均偶联成功。人工免疫抗原和人工包被抗原的偶联比均达到26∶1，为进一步制备抗血清和酶联检测方法的建立奠定了基础。
　　关键词：恩拉霉素;抗原合成;戊二醛法
　　中图分类号：S859.79+6         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2019）07-0092-04
　　Abstract： In order to establish an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for examing residual Enramycin （Er） in food. The antibody with high titer and specificity must be firstly prepared. So it was necessary for antibody production to conjugate the hapten （Er） with a carrier protein to synthesize immunogent（antigen）. Enramycin was coupled with carrier protein bovine serum albumin （BSA） to obtain immunogent （Er-BSA） by glutaraldehyde （GA） method and with ovalnumin （OVA） to obtain coating antigen（Er-OVA） by GA respectively. The successful linkage of Er-BSA and Er-OVA were identified by UV spectrophotometry. The UV spectral characterization demonstrated that Er-BSA and Er-OVA were successfully synthesized at 270～280 nm. The coupling ratios between Er and BSA or OVA were determined to be 26∶1， respectively.
　　Key words： Enramycin; synthesis of antigen; glutaraldehyde method
　　恩拉霉素（Enramycin，Er）又名恩霉素，是日本武田藥品研究所于1966年由土壤中分离出来的放线菌（Streptomyces fungicidious No. B5477）经发酵产生的一种由不饱和脂肪酸和十二种氨基酸结合而成的多肽类（Polypepide）抗生素[1-4]，其主要成分是恩拉霉素A：C107H138N26O31C12 R=CH3和恩拉霉素B：C108H140N26O31C12 R=C2H5OH，其结构式见图1。该药因具有很强的抗G+菌的作用，化学性能稳定，能促进畜禽生长和提高饲料效率，且不易产生耐药性，与其他抗生素亦无交叉耐药，无致突、致畸、致癌作用且适口性好等优势，现已成为最具发展前景的兽用抗生素添加剂。但目前国内外尚无有关Er酶免疫检测技术的报道[3-6]，仅日本厚生省对该项残留物质有畜、水产性食品常规检测技术报道[7]。因此建立Er残留物的免疫学检测方法非常必要，制备出特异性强、效价高的Er抗体非常关键，但是Er分子量小，不具免疫原性，只有与大分子载体蛋白偶联成为完全抗原后才能刺激动物机体发生特异性免疫反应。为此，本研究采用戊二醛法合成人工抗原，并用紫外光谱法（UV）鉴定抗原，为下一步制备抗Er多克隆抗体、单克隆抗体及检测试剂盒奠定了基础，以期为Er残留检测方法的建立提供研究材料。
　　1  材料与方法
　　1.1   材料与仪器
　　恩拉霉素（纯度≥98%，由“进出口动物产品恩拉霉素药残检测技术研究”课题组纯化，简称Er）;牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、弗氏完全佐剂（Freund's complete adjuvant，FCA）、弗氏不完全佐剂（Freund's incomplete adjuvant，FIA）、透析袋（截留分子量：14 000 Da）均购于Sigma公司;戊二醛、1，4-二氧六环、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4、Na2CO3、乙二胺四乙酸二钠（EDTA），以上化学试剂均为分析纯;去离子水;UV2501-PC型紫外扫描仪;BS124S型电子天平;BS100S型分析天平;ULT1386-3-V38型低温冰箱;DCD-172K型常规冰箱;Freeze 6型冷冻干燥机;DF-101S型智能集热式恒温加热磁力搅拌器。
　　1.2  方法
　　1.2.1  恩拉霉素-BSA免疫抗原的合成  采用戊二醛法（glutaraldehyde，GA）[7]合成恩拉霉素人工免疫抗原，其原理见图2。
　　1.2.2  试剂配制  磷酸盐缓冲溶液（PBS）：称取71.64 g Na2HPO4·2H2O和31.21 g NaH2PO4分别配制成0.20 mol/L的1 000 mL两种PBS溶液;戊二醛溶液：将其配成浓度为0.25%的100 mL戊二醛溶液;透析袋洗涤液：配制含碳酸钠10 g/L及EDTA 1 mol/L的碱性EDTA透析袋洗涤液。 　　1.2.3  抗原合成  将PBS配成pH=7.20的磷酸盐缓冲溶液100 mL于三角瓶中;称取Er 20 mg于100 mL锥形瓶中，称取BSA 20 mg于5号试管中。向试管中加配好的PBS溶液约3 mL，将BSA完全溶解后转移到Er的锥形瓶中，再用PBS洗涤试管，将BSA完全移入锥形瓶，共用PBS溶液10 mL。向锥形瓶中加入1，4-二氧六環10 mL，混匀。将磁力搅拌子放入锥形瓶后把锥形瓶放在一个含少量水的大烧杯中，再将烧杯置于25 ℃水浴，开启搅拌器。约5 min后，向反应器内逐滴加0.25%戊二醛溶液5 mL。滴加完毕后仍保持搅拌状态，反应4 h。
　　1.2.4  透析、干燥和保存  裁取长约20 cm的透析袋（分子截留量14 000 Da），将其置于碱性EDTA中煮沸30 min后用去离子水洗净。取100 cm长的棉线一根，用其一端将透析袋的一端扎紧。取15 cm的三角漏斗一个，将其下部插于透析袋的未封口端，将上一步所得反应物经由漏斗口转移至透析带内。转移完毕，利用棉线的另一端将透析袋封口。以一个小镊子为梁将装好的透析袋悬于盛有适量去离子水的大烧杯中（烧杯内的水能完全浸没透析袋内的液体）。将该装置放在4 ℃的冰箱内透析72 h，每天换水2次。将透析袋内液体转入20 cm平皿中，并用橡皮筋将薄膜固定封口。用镊子的尖端在平整紧绷的薄膜表面扎出若干小孔，-20 ℃下冷冻干燥2 d。将冻干的絮状产物分为两部分：一部分于4 ℃下保存供测试用，一部分于-20 ℃分装保存供免疫用。
　　1.2.5  Er-OVA包被抗原的合成  包被抗原的制备与合成方法基本与免疫抗原制备方法相同，仅将所用的BSA连接蛋白置换成OVA，制备成Er-OVA包被抗原，合成路线见图3。该抗原合成后可为免疫动物抗血清效价的检测和ELISA检测方法的建立奠定基础。
　　1.2.6  紫外吸收光谱法鉴定  配制 BSA、OVA、Er 标准溶液， 将BSA、OVA、Er、Er-BSA、Er-OVA进行适当比例稀释，使物质最大吸光度不超过4.0，以PBS为参比溶液，在200～400 nm范围内进行紫外扫描，分别记录吸收峰并根据最大吸收峰是否发生偏移，判断完全抗原合成成功与否[8-11]。
　　1.2.7  抗原蛋白质量浓度的测定  偶联物的绝对含量通常以蛋白质的相对质量浓度来表示（即每1 mL偶联物溶液中含蛋白质多少毫克），所以可通过测定偶联物中蛋白质的相对含量（mg/mL）来测定偶联物浓度[12]。于紫外光谱波长280 nm和260 nm处检测抗原蛋白的吸光度（OD值），通过公式（1）计算抗原蛋白相对浓度（mg/mL）[13]。根据蛋白质量浓度推算大白兔免疫剂量，进行抗血清（抗体，Ab）制备，为ELISA快速检测试剂盒的构建提供素材。
　　蛋白质量浓度（mg/mL）=（1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm）×稀释倍数   （1）
　　1.2.8  抗原偶联比计算  用紫外分光光度法测定恩拉霉素人工抗原分子偶联比。分别配制质量浓度2.5 mg/mL的BSA免疫抗原、2.0 mg/mL的OVA包被抗原工作液，进行紫外全波长扫描，利用214 nm和278 nm处OD值通过公式计算得出偶联比（即Lambert-Beer定律计算偶联比）[14]。
　　2  结果与分析
　　2.1  人工抗原的紫外光谱鉴定
　　采用UV2501-PC型紫外扫描仪对Er、BSA、OVA和2种制备抗原进行紫外全波段扫描，波长范围200～400 nm。结果得出，Er标准品紫外最大吸收波长为279 nm，BSA紫外最大吸收波长为278 nm。当Er与BSA偶联形成免疫抗原后，其紫外最大吸收波长偏移至Er和BSA特征峰之间，提示本次合成得到了Er与BSA偶联的免疫抗原Er-BSA（图4）。而从图5可以看出，Er和OVA偶联产物的紫外全波段扫描曲线较之于反应物OVA，峰形变缓，278 nm的最大吸收峰稍向左移，形状更接近于Er，初步说明偶联成功。此外，此次所得Er-OVA产物曲线较之之前的Er-BSA曲线稍有波动，可能与反应物纯度有关，BSA的纯度达到了98%，而OVA纯度不到90%。
　　2.2  抗原偶联比
　　利用表1、图4和图5的数据，根据公式（2）分别计算得到Er-BSA的免疫抗原偶联比为26.04∶1，Er-OVA的包被抗原偶联比为26.07∶1。
　　3  小结与讨论
　　3.1  抗原合成方法
　　对半抗原而言，人工抗原的合成和改造是免疫检测研究的第一步，能否成功合成全抗原是非常重要的。另外，作为一个完全抗原必须同时具备T细胞和B细胞表位。小分子物质由于分子太小一般难以同时拥有2个表位，必须将其连接到一些大分子蛋白载体以形成偶联物，借助大分子T细胞表位间接诱导B细胞激活、分化增殖，产生针对半抗原的特异性抗体[15，16]。在人工抗原的合成中，要注意尽量保留人工抗原中原有半抗原的原始立体构象和电子分布特征，半抗原分子越少，越应注意保留其特征基团不被改变[17]。Er是低分子多肽类化合物，是仅具反应原性而不具免疫原性的半抗原，其结构中氨基和酚基均可作为偶联基团，但以往的试验数据表明，酚基偶联的效果不佳，故选用氨基为偶联基团。因此，在不改变半抗原特征性结构的前提下，采用戊二醛法同时合成免疫原和包被原，期望制备出特异性强、选择性好、对间隔臂亲和性低的抗体[16];同时，由于戊二醛带有2个活性基团的双功能连接剂，借助其两端的醛基将载体和半抗原的氨基连接在一起，可较重氮化法UV吸收峰不易重叠。 　　试验通过偶联剂戊二醛将载体蛋白氨基与半抗原Er分子中D-Orn4和Cit-9上的氨基偶联，整个偶联反应在PBS和二氧六环反应条件下进行，其中PBS具有稳定反应的pH，并为反应提供水溶液环境，二氧六环既可调整反应环境的极性条件，又能促进醛基的反应，最终获得全抗原Er-BSA和Er-OVA，且通过紫外光扫描判断偶联成功。
　　3.2  载体蛋白的选择
　　已报道的载体主要有蛋白质载体，如BSA、OVA、钥孔血蓝蛋白（KLH）、人血清蛋白（HSA）等;多聚钛，如多聚赖氨酸、寡聚赖氨酸等;大分子聚合物，如羧甲基纤维素聚乙烯吡咯烷酮等。蛋白载体较为常用， 尤其是BSA分子中含有大量的赖氨酸，故有许多自由氨基存在， 且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度，被有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时其活性基团仍呈可溶状态。OVA的理化性质不及BSA稳定，其对交联反应的条件变化耐受性较差，但与BSA的亲缘关系较远，交叉反应程度却很低，选用OVA在特异性试验中能很方便地去除针对BSA的抗体，降低试验中的劳动强度。同时对其他可选用的载体蛋白而言，OVA也廉价易得;故本试验制备免疫原和包被原分别用的是BSA和OVA[18-20]。
　　3.3  抗原偶联比
　　人工抗原质量鉴定的一个最重要的方面是确认半抗原与载体的连接和测定结合比，半抗原与载体偶联时，连接过多的半抗原，并不意味着实际的免疫效果就一定好，结合物中半抗原分子数目太多或太少，诱发抗体的能力都很差。偶联物的结合比是指偶联物中半抗原与载体蛋白的分子个数之比，结合比适当的偶联物作人工抗原，能够获得特异性强、效价高的抗血清。以BSA为载体的偶联物，关于最佳偶联比，不同研究者的结果有所不同，通常认为半抗原分子与载体蛋白的偶联比在5∶1～30∶1最佳[21]。试验通过对合成物的相关因素和相关条件进行正交设计优化后，结果符合推荐范围。
　　3.4  人工抗原的鉴定方法
　　小分子完全抗原鉴定的方法有很多，如IR、核磁共振碳谱（C13-NMR）、飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）和标记抗原示踪法等，IR和C13-NMR可准确测定待测物的化学结构， 但上述方法试验操作费时、步骤繁琐、实验条件要求高、仪器设备购买和使用成本高、同时对操作人员的相关知识结构和操作经验要求高[22，23]。一般合成初期采用物理学方法（如UV、SDS-PAGE电泳、红外色谱等）进行初步鉴定[24]，UV法可同时计算偶联比， 且操作简单快捷， 被广泛使用。本试验从实验条件，生产实用性和推广应用等方面考虑， 选用UV作为鉴定人工抗原是否合成成功[25]。虽然理化方法检验是必要的，但只有特异抗体的出现才是对全抗原及其合成步骤的最好检验，可为Er的多克隆和单克隆抗体的研制、ELISA的建立提供技术基础。
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