烟草PP2C家族基因降雨量响应表达模式分析

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　　摘  要：PP2C是一类单体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，广泛参与生物体内多个信号转导。PP2C基因家族的鉴定和功能研究已在多种作物上报道。为探明不同降雨量条件下烟草PP2C基因家族表达特征，通过塑料大棚内模拟人工定量喷灌試验和不同降雨量的田间试验，利用RNA-Seq技术对移栽后40和60 d烟叶中PP2C家族基因进行了表达分析。结果显示，18个烟草PP2C家族基因的表达明显受降雨量影响，可分成9个亚族。其中6个PP2C家族成员的表达随着降雨量增大而降低，4个PP2C家族成员的表达随着降雨量增大而升高。本研究初步探明了云烟87中受降雨量影响的PP2C基因家族种类及其表达特点，为抗旱育种和抗旱栽培提供参考。
　　关键词：烟草;降雨量;PP2C;生物信息学
　　中图分类号：S572.01          文章编号：1007-5119（2019）02-0044-08      DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.02.007
　　Abstract： PP2C is a class of monomeric serine/threonine protein phosphatases that are widely involved in multiple signal transduction pathways in organisms. Identification and functional studies of the PP2C gene family have been reported in a variety of crops. In order to ascertain the expression characteristics of tobacco PP2C gene family members under different rainfall conditions， the expression of PP2C family genes in tobacco leaves at 40 and 60 days after transplanting was analyzed by RNA-Seq technique through simulated artificial quantitative irrigation in plastic greenhouse and field experiments with different rainfall. The results showed that the expression of 18 tobacco PP2C family genes was significantly affected by rainfall and could be divided into 9 subfamilies. The expression of six PP2C family members decreased with increasing rainfall， and the expression of four PP2C family members increased with increasing rainfall. In this study we have preliminarily identified the types and expression characteristics of the PP2C gene family affected by rainfall in Yunyan 87， providing reference for drought-resistant breeding and drought-resistant cultivation.
　　生物体内普遍存在由蛋白激酶和蛋白磷酸酶介导的可逆磷酸化反应，在调控植物细胞信号转导和逆境胁迫响应过程中发挥着重要作用[1]。针对不同特异性底物和特定抑制剂敏感性不同，蛋白磷酸酶（PPs）通常被分为PP1，PP2A，PP2B或PP2C[2]。PP2Cs是一类依赖Mg2+或Mn2+的单体丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶[3-4]，也是高等植物中最大的蛋白磷酸酶家族[5]，在真核生物脱落酸、茉莉酸、水杨酸等信号传导途径中起着重要的调控作用[6-7]。研究发现，拟南芥中有80个PP2C基因[8]，水稻中有78个[9]，其中拟南芥PP2C基因被分为A-E、F1、F2、G-L共13个亚族[8]。相关研究显示，PP2C酶催化可逆磷酸化作用，并反作用特定蛋白激酶，调控ABA信号通路，与水分等非生物逆境胁迫的耐受性相关，进而影响植物生长发育[10]。
　　水分是影响烟草生长的重要因子，除了灌溉外，降雨是烟草生长水分供应的关键途径[11]。我国许多烟区年降雨量分布不均，影响烟叶的产量和品质[12]。作为重要的生态因子，降雨量影响着烟草基因的表达[11]。目前对烟草中PP2C家族基因虽有一些报道[13]，但不同降雨量条件下烟草PP2C家族基因的表达尚未见相关研究，本研究利用已公开的NCBI烟草基因组数据（PRJNA319578、PRJNA208209）结合本实验室建立的云烟87烟草转录组数据库（PRJNA206414）进行PP2C家族基因的预测，对塑料大棚内降雨量模拟试验和不同降雨量田间试验下的云烟87叶片样品进行RNA-Seq，结合生物信息学分析，探究了降雨量对烟草PP2C家族基因表达的影响，为烟草的抗旱育种与栽培提供指导。
　　1  材料与方法
　　1.1  试验处理
　　试验分为塑料大棚内模拟试验和大田验证试验两部分。供试烤烟品种为云烟87。 　　模拟试验在云南玉溪赵桅烤烟试验点（102.29° E，24.18° N，海拔1645 m）进行，搭建简易塑料大棚进行避雨栽培，大棚四周通风良好，棚内温度条件与室外试验基本一致。参照降雨量有显著差异的云南3个地区34年的年均降雨量及其旬分布特征，设計低、中、高3个降雨量处理：低降雨量（≤500 mm，典型区域为东川）、中等降雨量（650～700 mm，典型区域为江川）和高降雨量（≥1100 mm，典型区域为宁洱），进行降雨量模拟人工定量喷灌。3个处理移栽后0～40 d的模拟旬降雨量分别为32、42和71 mm（与东川、江川、宁洱3地34年平均降雨量等同），移栽后40～60 d模拟旬降雨量分别为30、53和90 mm，每5天模拟降雨1次。每个处理设3个小区（重复），每个小区按照株行距50 cm×120 cm栽种36株烤烟，小区规格为6 m×3.6 m，小区四周各设2列保护行。其他栽培管理措施与常规大田试验相同。
　　为了验证塑料大棚内降雨量模拟试验中PP2C家族基因表达变化情况，在文山砚山（104.38° E，23.59° N，海拔1540 m）、普洱宁洱（101.08° E，23.06° N，海拔1340 m）和玉溪江川（102.75° E，24.32° N，海拔1725 m）3个地点进行大田验证。烟苗移栽成活后不浇水，统计当地实际降雨量。砚山、宁洱、江川移栽后0～40 d实际旬均降雨量分别为13 mm、11.5 mm、124 mm，移栽后40～60 d实际旬均降雨量分别为18 mm、19 mm、227 mm。塑料大棚内模拟试验及大田验证试验的旬降雨量统计见图1。
　　1.2  RNA-Seq技术
　　塑料大棚内模拟试验和大田验证试验分别在移栽40和60 d后取样，每个小区取3株烟，选取从下向上第10叶（中部烟叶），3个叶片混合作为一个样品，每个处理共3次生物学重复。用不锈钢剪刀剪去叶尖、叶基和主脉，取叶片中部，用铝箔纸包裹好后用液氮速冻，分装50 mL离心管中，?80 ℃储存，用于RNA-Seq测序分析。
　　使用改良的CTAB法提取样品总RNA。取质量合格的总RNA 6 μg，利用Oligo（dT）磁珠富集mRNA，反转录合成双链cDNA，对cDNA片段进行末端修复和衔接子连接后，将产物纯化并用PCR富集以产生最终的cDNA文库。文库质控合格后使用Illumina HiSeq?2000进行测序。将获得的原始读段（reads）经过去接头和低质量碱基的清洗获得clean reads，并对参考数据通过Tophat进行短序列比对获得SAM数据文件。SAM交由cufflinks软件包做差异分析获得基因的表达量（RPKM值）。对表达量相差两倍以上，P<0.05的PP2C家族基因进行差异分析[14]。
　　1.3  烟草PP2C候选基因的鉴定及生物信息学分析
　　利用已公开的NCBI烟草基因组数据（PRJNA319578、PRJNA208209）结合实验室建立的云烟87烟草转录组数据库（PRJNA206414）进行PP2C家族基因的预测，获得56个云烟87的PP2C家族基因。挑选2个以上处理RPKM值大于1的基因作为对降雨量有明显响应的PP2C家族基因，最终获得18个候选PP2C家族基因。进行NCBI和中国烟草基因组数据库Blast比对、ORF分析（NCBI ORFfinder，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/）、结构域分析（Pfam database，http：//pfam.xfam.org/）、蛋白理化性质预测（ExPASy，http：//web.expasy.org/protparam/）、亚细胞定位预测（WoLF PSORT，http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）和Clustalx氨基酸多序列比对以及MEGA5.0系统进化关系分析。
　　1.4  不同降雨量下表达模式分析
　　2  结  果
　　2.1  表达受降雨量影响的烟草PP2C家族基因鉴定
　　利用RNA-Seq测序获得18个随降雨量变化有明显响应并具有完整ORF的候选PP2C基因家族成员。通过在NCBI数据库和中国烟草基因组数据库比对分别命名为NtPP2C01、NtPP2C10、NtPP2C12、NtPP2C27、NtPP2C28、NtPP2C33、NtPP2C34、NtPP2C35、NtPP2C37、NtPP2C43、NtPP2C49、NtPP2C50、NtPP2C52、NtPP2C58、NtPP2C59、NtPP2C60、NtPP2C63、NtPP2C76。通过分析NtPP2C家族基因理化性质，结果显示18个NtPP2C基因家族成员中，蛋白质编码最长的526 aa，最短的267 aa，等电位范围从4.49～9.19，18个烟草PP2C家族基因均含有PP2C保守结构域（表1）。
　　2.2  表达受降雨量影响的烟草PP2C家族基因亚细胞定位预测
　　利用WoLF PSORT对18个烟草PP2C家族基因进行亚细胞定位预测，结果表明表达受降雨量影响的烟草PP2C家族基因在细胞核、细胞质、线粒体和叶绿体中表达集中，在过氧化物酶体、细胞骨架、液泡、高尔基体和细胞基质中少量表达，在细胞膜和内质网中不表达（表2）。表达受降雨量影响的烟草PP2C家族基因表达部位的不同可能与其执行不同的功能有关。
　　2.3  表达受降雨量影响的烟草PP2C基因编码蛋白系统进化树构建
　　个与烟草候选PP2C基因蛋白同源性相近的水稻PP2C基因编码蛋白，利用MEGA5构建系统进化树（图2），根据拟南芥和水稻PP2C基因的分类，18个云烟87烟草的PP2C基因分别属于A、D、E、F1、F2、G、H、K、L 9个亚族。其中NtPP2C37和NtPP2C50属于A亚族，NtPP2C43、NtPP2C60和NtPP2C63属于D亚族，NtPP2C33、NtPP2C34和NtPP2C52属于E亚族，NtPP2C10、NtPP2C28和NtPP2C58属于F1亚族，NtPP2C59和NtPP2C76属于F2亚族，NtPP2C27和NtPP2C49属于G亚族， NtPP2C12属于H亚族，NtPP2C01属于K亚族， NtPP2C35属于L亚族。 　　2.4  表達受降雨量影响的烟草PP2C基因表达趋势
　　按照降雨量从低到高排列，通过塑料大棚内数据（图3）和大田验证数据（图4）比较后发现，
　　塑料大棚内试验云烟87的PP2C家族基因在移栽后40 d没有移栽后60 d的变化显著。可能是移栽后40 d烤烟正处于团棵期后期，而移栽后60 d烤烟正处于旺长期，烤烟旺长期对水分和降雨量更为敏感，因此PP2C家族基因的表达差异大。并且在塑料大棚内精准调控条件下，基因家族表达的规律性更强，所以在随后PP2C家族基因表达变化的分析中，主要以60 d获得的数据为主。采用基因表达随降雨量的高低变化进行趋势分析。试验结果表明，塑料大棚内和大田验证试验中NtPP2C37、NtPP2C63、NtPP2C34、NtPP2C10、NtPP2C58、NtPP2C49  6个基因总体表达随着降雨量的增大而降低。NtPP2C50、NtPP2C43、NtPP2C33、NtPP2C52  4个基因总体表达随着降雨量的增大而升高。
　　3  讨  论
　　利用RNA-Seq可以很方便地对植物基因表达情况进行分析[15]。本研究分别在塑料大棚内模拟和大田不同降雨量下开展烟草栽培试验，并采集栽后40 d和栽后60 d不同处理的样品，通过RNA-Seq，共鉴定了18个对降雨量有明显响应的烟草PP2C家族基因。基因定位预测表明，这18个烟草PP2C家族基因主要在细胞质、叶绿体、线粒体和细胞核中表达。根据烟草、拟南芥和水稻PP2C基因编码蛋白进化树构建结果，将18个烟草PP2C家族基因分成9个亚族：A、D、E、F1、F2、G、H、K、L亚族。
　　PP2C是一类具有多种功能的蛋白磷酸酶，在植物水分胁迫过程中发挥着重要的作用[16-17]。相关研究显示，A亚族调控脱落酸（abscisic acid，ABA）信号途径[18]，拟南芥ABI1和ABI2基因属于A亚族[19]，是ABA信号途径中的调控基因[20-21]。B亚族在蛋白激酶MAPK途径起作用[22]，苜蓿中B亚族是MAPK途径中的负调控因子，受逆境胁迫诱导[23-24]。C亚族与花器官发育相关[4]。G亚族拟南芥基因AtPP2CG1能够调控拟南芥对盐胁迫的响应[25]。E亚族在丹参中预测与植物组织器官发育相关[26]。
　　基因调控是复杂而多元化的过程，塑料大棚内环境较单一，诱导基因家族表达的条件可控，通过综合分析塑料大棚内和大田试验不同降雨量下PP2C基因家族表达量变化，NtPP2C37、NtPP2C63、NtPP2C34、NtPP2C10、NtPP2C58、NtPP2C49六个基因总体表达随着降雨量的增大而降低，可能与干旱胁迫等非逆境胁迫相关。赵娜[27]研究发现中间锦鸡儿CiPP2C37-like在干旱、高盐、低温和ABA胁迫下表达量上调。闵东红等[1]发现在干旱胁迫处理下，谷子SiPP2C10相对表达量上调2倍以上。这与本文研究结果相一致，推测NtPP2C37和NtPP2C10为抗旱相关基因。NtPP2C50、NtPP2C43、NtPP2C33、NtPP2C52四个基因总体表达随着降雨量的增大而升高，可能与烟草水分代谢相关。同家族中不同基因差异表达结果不尽相同，可能是存在不同的应答机制。
　　水分是影响烟草生长发育的重要环境因子，烟草产量和质量的形成很大程度上决定于其生育期水分供应。随着降雨量增多，烟草中发生了丰富的基因调控变化[11]，通过研究低、中、高降雨量下PP2C家族基因的表达变化，可以有针对性地筛选与抗旱性有关的PP2C家族基因，为后续抗旱育种和抗旱栽培奠定基础。
　　4  结  论
　　本研究利用NCBI烟草基因组数据结合实验室建立的云烟87烟草转录组数据库，通过RNA-Seq技术发现了云烟87中18个对不同降雨量有明显响应的PP2C家族基因，可分成9个亚家族。其中6个PP2C家族成员的表达随着降雨量的增多而降低，4个PP2C家族成员的表达随着降雨量增多而升高。本研究可为抗旱育种和抗旱栽培提供参考。
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