树鼩肠道菌群多样性与功能预测研究

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　　摘要[目的]鉴定树鼩的肠道菌群，分析树鼩肠道菌群多样性和丰度，并进行菌群功能预测。[方法]随机采集3份雄性树鼩粪便样品，提取树鼩粪便中细菌基因组DNA，通过PCR扩增获得16S rRNA V3～V4片段，采用高通量Illumina PE300 平台进行测序，利用BIPES以及QIIME分析并比较菌群结构及多样性。最后，通过PICRUS t软件对肠道菌群的功能进行预测。[结果]树鼩肠道粪便细菌有9门20纲33目53属122种208个OTU。门水平上，优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）；
　　属水平上，埃希氏杆菌属（Escherichia）、乳酸菌属（Lactobacillus）和肠球菌属（Enterocossus）为优势菌群。PICRUS t功能预测结果表明，肠道细菌编码的大多数基因与代谢相关，其次是基因信息加工、环境信息加工。COG功能分类分析表明肠道微生物基因在“氨基酸的运输和代谢”和“碳水化合物运输与代谢”功能类群的相对丰度较高。[结论]PICRUS t功能预测到树鼩肠道菌群主要与代谢相关，树鼩肠道菌群是研究肠道菌群与代谢类疾病的一种良好试验材料。
　　关键词树鼩；肠道菌群；16S rRNA；菌株功能
　　中图分类号S852.21文献标识码A
　　文章编号0517-6611（2019）08-0101-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.026
　　Abstract[Objective]To identify the intestinal flora of Tupaia belangeri，analyze the diversity and abundance，and predict the function of the flora.[Method]Three male feces samples of T.belangeri were randomly collected，bacterial genomic DNA were extracted from the feces samples of T.belangeri to make PCR amplification.16S rRNA V3V4 fragments were obtained.The highthroughput Illumina PE300 platform was used for sequencing，and the structure and diversity of the bacterial flora were analyzed by BIPES and QIIME.The function of intestinal flora was predicted through PICRUS t.[Result]There were 9 phyla，20 phyla，33 orders，53 genera，122 species，208 OTU in the intestinal fecal flora of T.belangeri.Firmicutes and Proteobacteria dominated at the level of phylum.
　　At the level of genus，Escherichia，Lactobacillus and Enterocossus were the dominant flora.The functional prediction results by PICRUS t showed that most genes encoded by gut bacteria were associated with metabolic "metabolism"，followed by genetic information processing "based information processing"，environmental information processing "environmental information processing".COG gene function classification statistics showed that the relative abundance of intestinal flora in "amino acid transport and metabolism" and "carbohydrate transport and metabolism" were higher.[Conclusion]The function of PICRUS t predicted that the intestinal flora of T.belangeri was mainly related with the metabolism，and the intestinal flora of T.belangeri was a good experimental material for studying intestinal flora and metabolic diseases.
　　Key wordsTupaia belangeri；Intestinal flora；16S rRNA；Function of strain
　　樹鼩隶属攀缘目（Scandentia）树鼩科（Tupaiidae），是灵长类动物的近亲[1]。研究表明，树鼩在进化关系、解剖结构、新陈代谢等方面比大鼠、小鼠更接近于人类[2]，常用于替代或减少一些非人灵长类动物的使用，在肿瘤学、内分泌学、神经生物学、生殖生物学、免疫学等方面对树鼩已有广泛和深入的研究[3]。 　　肠道是人体最大的消化和排泄器官，存在数以亿计的微生物与宿主共生，肠道菌群是宿主不可或缺的一部分。正常肠道菌群在宿主营养代谢、药物代谢、免疫调节等方面起着重要作用[4]。肠道菌群与宿主免疫系统的相互作用是彼此多方向的、交互式的化学交流传递通道[5]。肠道菌群产生的胆汁酸、胆碱、短链脂肪酸是宿主健康所必需的物质[6]。机体的正常活动以及消化食物、机体免疫功能及抗病能力、排便功能等都离不开菌群的参与，并需要它们发挥应有的作用，正常菌群的失调可能导致诸多疾病[7]。
　　以前采用传统的分离与培养、构建克隆文库、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）、荧光原位杂交（FISH）等方法揭示肠道微生物的多样性[8]，但这些方法有很大的局限性。高通量测序技术作为新一代的测序方法，具有较高的准确性和灵敏度，极大地提高了对样品中微生物多样性分析的深度和广度，加深人们对肠道微生物菌群的结构和功能的了解。基于细菌16S rRNA 的高通量基因测序分析已成为研究肠道菌群与疾病间关系的重要工具。笔者通过高通量测序细菌16S rRNA基因的V3～V4区测序，鉴定树鼩的肠道菌群，对树鼩肠道菌群多样性、丰度和菌群功能代谢进行了预测。
　　1材料与方法
　　1.1试验动物
　　3只健康成年雄性树鼩，体重140～160 g，来源于昆明医科大学实验动物学部[SCXK（滇） K2013-0002]，饲养于昆明医科大学普通级实验室，单笼饲养，饮用城市供应的自来水，每日定时饲喂全价颗粒饲料，动物饲养温度22～25 ℃，湿度 40%～60%，明暗交替照明12 h。
　　1.2方法
　　1.2.1树鼩粪便的收集。抓取并保定树鼩，多数树鼩在抓取过程中因紧张而主动排出粪便，对无粪便者轻轻按摩其腹部，使其排便，每只树鼩采集豌豆粒大小的新鲜粪便标本。
　　1.2.2粪便样品的混悬与稀释。将粪便样品混悬到无菌生理盐水中后，以10倍递增梯度进行稀释。
　　1.2.3DNA的提取与检测。
　　使用粪便基因组提取试剂盒E.Z.N.A. soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.），从树鼩粪便样品中提取细菌DNA，并利用1%琼脂糖凝胶电泳进行定性检测。
　　1.2.4PCR扩增。按照指定测序区域，扩增的目标区域为16S rRNA基因的V3和V4区域，引物名称为338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′） ，合成带有barcode的特异引物。
　　1.2.5荧光定量。
　　参照电泳初步定量结果，将PCR产物用Quanti FluorTM -ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，此后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
　　1.2.6Miseq文库构建和Miseq测序。文库的制备和上机测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。
　　1.3生物信息学分析Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，按照97%相似性对非重复序列进行OTU（operational taxonomic unit）聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列，将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。基于Silva数据库，应用RDP classifier 2.2对每个OTU的最长16S rRNA序列片段进行相似性比对，统计每个样本中细菌在门、纲、目、科、属、种各分类水平上的构成[9]。在上述分析的基础上，对树鼩肠道菌群代谢功能预测等进行分析。
　　PICRUS t对OTU丰度表进行标准化，去除16S marker gene在物种基因组中的拷贝数目的影响；然后，通过每个OTU 对应的green gene id，比对到COG和KEGG库，获得OTU对应的COG家族信息和KO信息；计算各COG的丰度和KO丰度。根据比对到COG库的COG编号，可以从基因的進化谱系（egg NOG）数据库中解析到各个COG的描述信息及其功能信息，从而得到功能丰度谱；根据比对到KEGG数据库的信息，获得KO、Pathway、EC信息，并根据OTU丰度计算各功能类别的丰度。
　　2结果与分析
　　2.1测序结果物种注释与评估
　　从3只成年雄性树鼩的粪便样品中共得到高质量质控序列58 328条，序列长度主要分布在441～460 bp，其他少量分布在421～440 bp。
　　2.1.1树鼩肠道菌群α-多样性指数分析。从图1可以看出，3个树鼩样品的α-多样性相差不大。
　　2.1.2OTUs稀释曲线。从图2可以看出，随着测序深度的逐渐增加，OTUs稀释曲线趋于平坦，说明更多的测序数量对于OTU的边际贡献较小，测序的数据量较为合理。3个样品的稀释曲线趋于平缓（图2），说明样品测序量是足够的，足以覆盖所有微生物的组成。
　　2.2树鼩肠道菌群的物种组成分析
　　在97%的相似水平上进行OTU序列分类，共聚成208个可操作分类单元（OUT）。肠道细菌隶属9门20纲33目53属122种。这9个门分别为放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、拟 杆 菌 门 （Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、 柔膜菌门（Tenericutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、螺旋体菌门（Saccharibacteria）。从图3可以看出，门水平上优势菌群为变形菌门（Proteobacteria，占61.22%）和厚壁菌门（Firmicutes，占36.65%）。从图4可以看出，属水平上埃希氏杆菌属（Escherichia）占59.72%，乳酸菌属（Lactobacillus）占26.86%，肠球菌属（Enterocossus）占6.36%，这3个属为优势菌群。 　　2.3PICRUS t软件预测
　　肠道细菌菌群功能基因和代谢途径分布表明，KEGG代谢通路中树鼩肠道细菌编码的大多数基因与代谢相关（表1）。COG功能分類统计结果表明，微生物基因在“氨基酸的运输和代谢”和“碳水化合物运输与代谢”功能类群的相对丰度较高（图5）。
　　3讨论
　　笔者通过16S rRNA高通量测序分析树鼩肠道菌群，共得到9门20纲33目53属122种208个OUT。该试验覆盖率为0.99，说明树鼩大肠细菌99.9%多样性情况得到体现。每个样本的稀释曲线都趋于平缓，表明该试验的测序量能够覆盖各样本的大多数微生物。树鼩肠道细菌门水平上丰度较高的是变形菌门和厚壁菌门。其他菌群为放线菌门、拟杆菌门、疣微菌门、柔壁菌门、梭杆菌门（Fusobacteria）、蓝细菌门、螺旋体菌门。在门水平上，树鼩肠道菌群比啮齿类动物（大鼠、小鼠）更接近于人类。研究表明，小鼠肠道菌群在门水平上主要为放线菌门、拟杆菌门、脱铁杆菌门（Deferribactcres）、广古菌门（Euryarchaeota）、壁厚菌门、变形菌门、柔壁菌门、疣微菌门9个门[10]。大鼠粪便菌群主要为厚壁菌门、拟杆菌门、蓝藻菌门、软壁菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门[11]。人体肠道中的菌群主要有拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门，这3门细菌占总细菌量的80%以上，其他细菌主要有蓝藻菌门、拟杆菌门、放线菌门、梭杆菌门、 疣微菌门、螺旋体菌门。在健康人类和树鼩肠道菌群被鉴定到的螺旋体菌门，在大小鼠肠道菌群中未被发现。
　　使用PICRUS t软件计算方法[12-13]预测微生物16S rRNA文库，对其功能基因和类群进行了探索，进而将菌群结构与宿主代谢相联系。研究表明，PICRUS t软件对肠道菌群功能基因预测的准确度为85%～90%[14]。该软件在 KEGG通路水平输出预测的代谢功能丰度，得到的通路谱用于下游比较分析。通过与KEGG的比对搜索，笔者发现肠道细菌编码的大多数基因与代谢相关，其次是基因信息加工、环境信息加工。
　　COG功能分类统计表明，肠道微生物基因在“氨基酸的运输和代谢”和“碳水化合物运输与代谢”功能类群的相对丰度较高，说明这些肠道细菌的主要功能是维持正常状态下细胞的基本生理活动。功能基因主要与代谢相关，推测树鼩肠道菌群可能是研究代谢类相关疾病的良好动物模型。
　　肠道菌群与宿主的营养、疾病的发生发展等密切相关[15]。宿主为肠道菌群的生长繁殖提供必要条件，菌群在肠道内代谢活动产生物质作用于宿主，影响宿主整个生命过程。肠道微生物在宿主体内具有抵御病原菌侵袭、促进免疫器官成熟、激活免疫系统发挥作用等功能，例如微生物可以与肠道黏膜上皮细胞结合，产生一些抑菌物质，发动非特异性防御功能[16]。厚壁菌门在肠道中能够帮助多糖发酵，厚壁菌门和拟杆菌门可协助宿主从本身无法消化的食物成分中提取更多的能量，维持动物肠道的健康[17]。因而，研究肠道菌群多样性及菌株对宿主的功能对于探讨人类疾病的发生机制具有重要意义。
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