口咽部正常菌群对肺炎支原体快速培养法试剂盒的影响

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　　摘要：目的  观察常见的口咽部正常菌群对肺炎支原体快速培养法试剂盒结果的影响，评价其临床实用性和可靠性。方法  用标准菌株和口咽部分离的临床菌株作为研究对象，观察不同细菌对培养结果的影响。结果  标准菌株肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、白念珠菌在试剂盒中的培养阳性率分别为0，10.00%，10.00%，10.00%，20.00%，临床分离的野生型和耐药型草绿色链球菌培养阳性率分别为5.00%，80.00%;表皮葡萄球菌为15.00%，90.00%;肺炎克雷伯菌为25.00%，80.00%，白念珠菌为20.00%，85.00%;鲍曼不动杆菌为90.00%，100.00%。除鲍曼不动杆菌外其它四种耐药型菌株的培养阳性率明显增高。结论  口咽部若存在耐药菌或多重耐药菌以及对某些抗生素有天然耐药机制的细菌时会造成肺炎支原体快速培养法检测结果出现假阳性，在试验结果报告中应注意其假阳性的问题。
　　关键词：肺炎支原体;快速培养;假阳性
　　中图分类号：R446.6                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.11.053
　　文章编号：1006-1959（2019）11-0171-03
　　Abstract：Objective  To observe the effect of common oropharyngeal normal flora on the results of the rapid culture method of Mycoplasma pneumoniae and evaluate its clinical applicability and reliability.Methods  The clinical strains isolated from standard strains and oropharynx were used as research objects to observe the effects of different bacteria on the culture results. Results  The positive rates of standard strains of Streptococcus pneumoniae， Staphylococcus aureus， Haemophilus influenzae， Escherichia coli and Candida albicans in the kit were 0， 10.00%， 10.00%， 10.00%， 20.00%， clinical The positive rates of isolated wild-type and drug-resistant S. cerevisiae cultures were 5.00% and 80.00%， respectively; Staphylococcus epidermidis was 15.00%， 90.00%; Klebsiella pneumoniae was 25.00%， 80.00%， and Candida albicans was 20.00%，85.00%; Acinetobacter baumannii was 90.00%， 100.00%. The positive rate of culture of the four drug-resistant strains except Acinetobacter baumannii was significantly increased.Conclusion If there are resistant or multi-drug resistant bacteria in the oropharynx and bacteria with natural resistance to certain antibiotics， the results of the rapid culture method of mycoplasma pneumoniae will be false positive， and the problem of false positives should be noted in the test results report.
　　Key words：Mycoplasma pneumoniae;Rapid culture;False positive
　　肺炎支原体（mycoplasma pneumonia，MP）可引起气管支气管炎和肺炎，学龄期儿童和青壮年是易感人群。这种感染在每3～7年间可呈现地区性或世界范围的流行。由于典型或非典型病原体引起的肺炎其临床表现和实验室检查结果会不同，并且临床常用的β内酰胺类抗生素对肺炎支原体无效，因此肺炎支原体肺炎获得病原学诊断非常重要[1]。研究显示，MP感染后 IgM抗体在1周后升高，在第3周达到峰值，其诊断MP敏感性为7.4%～33.3%，在部分成年患者中MP IgM可持续阴性。因此，如果将IgM检查作为唯一的实验室证据并不能提供正确的信息。与PCR方法相比时，收集呼吸道标本采用培养法检测MP敏感性为61.5%[2]。但是也有研究报道[3]，培养方法诊断MP感染时其不敏感性不能接受。国内的一项研究报道[1]，两种方法的阳性率没有区别。此外，诊断参数的价值包括特异性、敏感性、阳性和阴性预测值以及阳性似然比，培养法是3种方法中最高的[3]。然而，較长的培养时间影响了其临床应用价值。肺炎支原体快速培养法试剂盒其检测原理是样本洗脱在培养液中经适宜温度下恒温培养，若标本中含有肺炎支原体则快速繁衍增殖，通过快速生长，其代谢产物分解葡萄糖产酸，使介质pH值降低，培养基由红色变为黄色即为阳性。既往研究显示，肺炎支原体快速培养法比血清学检测有更高的假阳性率，有部分假阳性样本中能分离出一些临床常见的口腔正常菌群或致病菌。本研究旨在利用标准菌株和临床分离的耐药菌研究不同细菌对MP快速培养法结果是否有干扰作用，以及不同采样拭子对快速培养结果的影响。 　　1材料与方法
　　1.1一般资料  选择5株有溯源性的标准菌株和10株来自天津市宁河区医院住院患者口咽部标本分离的临床菌株（野生型和耐药型菌株各5株）作为研究对象，其中革兰阳性球菌6株，革兰阴性杆菌6株，酵母菌3株。标准菌株来源于美国菌种保藏中心（ATCC），由天津市临床检验中心提供。临床菌株分离自住院患者呼吸道标本，所有菌株经法国梅里埃Vitek 2compact 全自动细菌鉴定仪鉴定到种后留存备用。质控菌株ATCC15531肺炎支原體购自美国MBL公司。
　　1.2试剂和仪器  肺炎支原体6 h快检试剂盒（快速培养法）购自武汉菁华时间科技有限公司。MJX-250BⅢ细菌培养箱购自天津泰斯特仪器有限公司。一次性塑料棉拭子为肺炎支原体快检试剂盒配套产品，哥伦比亚血琼脂平板购自梅里埃（上海）生物制品有限公司，念珠菌显色平板购自郑州安图生物工程有限公司。
　　1.3方法  将待检菌株传代分别接种至哥伦比亚血琼脂平板和念珠菌显色平板35℃孵育过夜，用无菌棉拭子挑取数个单菌落置于0.9%NaCl中制成0.5麦氏单位的菌悬液（细菌个数相当于1.5×108/ml）。肺炎支原体试剂盒样本取材操作步骤按照说明书进行，将棉拭子在无菌生理盐水中浸湿后沾取菌液，在试管内壁挤压拭子上多余的液体，然后将棉拭子放入培养小瓶内搅动混匀数次，去除拭子的瓶外部分，旋紧瓶盖（35±1）℃孵育箱中培养6 h，液体培养基由红色变为清亮的黄色为阳性。培养液不变色或变淡为阴性，培养后试剂变黄色但是出现浑浊或出现絮状物判断为假阳性。每次试验在质控在控的情况下记录试验结果。
　　1.4统计学处理  使用SPSS 22.0进行统计学分析，计数资料多个率的比较采用行×列表的？字2检验，多个样本之间的两两比较采用多个样本率之间的多重比较。P<0.05表示差异具有统计学意义，P<0.01表示统计学意义显著。
　　2结果
　　2.1标准菌株对肺炎支原体快速检测试剂的影响  本研究使用的5株ATCC来源的标准菌株中，肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、白念珠菌在肺炎支原体快检培养法试剂盒的培养阳性率分别为0，10.00%，10.00%，10.00%，20.00%，各细菌间的培养阳性率比较，差异无统计学意义（？字2=2.22，P=0.69）。
　　2.2临床菌株对肺炎支原体快速检测试剂的影响  在临床菌株试验中，5种细菌同时选择野生型和耐药型菌株进行比较研究。对临床常用抗生素全敏感的野生型菌株：草绿色链球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、白念珠菌在肺炎支原体快速检测试剂中培养后结果阳性率显著低于耐药型菌株（P<0.01）。野生型和耐药型菌株比较，草绿色链球菌分别为5.00%，80.00%;表皮葡萄球菌为15.00%，90.00%;肺炎克雷伯菌为25.00%，80.00%，白念珠菌为20.00%，85.00%;各组两两比较统计学意义显著（P<0.01）。但鲍曼不动杆菌野生型和耐药型之间的培养阳性率分别为90.00%，100.00%，组间比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
　　3讨论
　　针对肺炎支原体快速培养试剂盒的临床研究有很多，但大多数集中在其与血清学抗体检测、PCR法基因检测等方法学的比较研究[4，5]。对快速培养法的敏感性、特异性的研究也有很多不同的报道。赵汉青等[6]研究显示，从培养阳性但PCR检测阴性的标本中进行真菌和细菌16S rRNA检测发现真菌污染是引起MP快速鉴定培养基特异性差的主要原因。郭义兵[7]研究发现，某些细菌能够分解尿素，产生二氧化碳改变培养液PH值，从而影响结果。
　　本研究发现，不论是使用标准菌株还是临床分离菌株，口咽部常见细菌和真菌如果对常用抗菌药物敏感（主要是β内酰胺类药物），则对肺炎支原体6 h快速检测试剂盒结果无明显影响。如果培养液中加入的是对β内酰胺类药物耐药的细菌或多重耐药菌则会严重干扰检测结果造成较高的假阳性率，这可能是由于该试剂盒中加入的抗生素不能抑制所耐药细菌有关。这与李昌庆等[8]的研究结果有所不同，其研究结果显示，咽拭子中若含有口腔细菌则会使肺炎支原体培养假阳性率增高。但该研究未明确口腔菌群是否为耐药菌。因此，在结果判读时，有必要将阳性培养物涂片后革兰染色镜检，这样可在一定程度上排除耐药性细菌和真菌对结果的干扰。
　　从本研究来看，肺炎支原体6 h快检试剂对的口腔常见的对抗生素敏感的正常菌群和呼吸道常见致病菌有良好的抗干扰作用，而且酵母菌对该试剂培养结果也无明显的影响。但是耐药菌株增加了肺炎支原体培养的假阳性。因此，在使用该试剂盒进行MP培养时要注意口腔耐药菌的影响。
　　参考文献：
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　　[2]Katsushima Y，Katsushima F，Suzuki Y，et al.Characteristics of Mycoplasma pneumoniae infection identified on culture in a pediatric clinic[J].Pediatr Int，2015，57（2）：247-252.
　　[3]Zhao F，Liu L，Tao X，et al.Culture-Independent Detection and Genotyping of Mycoplasma pneumoniae in Clinical Specimens from Beijing，China[J].PLoS One，2015，10（10）：e0141702.
　　[4]Ma YJ，Wang SM，Cho YH，et al.Clinical and epidemiological characteristics in children with community-acquired mycoplasma pneumonia in Taiwan：A nationwide surveillance[J].J Microbiol Immunol Infect，2015，48（6）：632-638.
　　[5]路畅，马艺铭.快速血清学检验和微生物快速培养检测诊断小儿肺炎支原体感染的价值分析[J].临床检验杂志（电子版），2018，7（3）：382-383
　　[6]赵汉青，闫超，孙红妹，等.肺炎支原体快速液体培养法的评价和存在的问题[J].中华微生物学和免疫学杂志，2016，36（7）：517-518.
　　[7]郭义兵.影响肺炎支原体液体培养假阳性的因素分析[J].医药前沿，2016，6（13）：393-394.
　　[8]李昌庆，李岑，熊燕，等.肺炎支原体液体培养法的实验诊断学评价[J].四川医学，2016，37（12）：1362-1366.
　　收稿日期：2019-2-13;修回日期：2019-2-23
　　编辑/成森
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