食品微生物快速检验和无菌操作技术
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摘 要：在食品质量检验过程中，要根据实际情况合理选用阻抗法、多聚酶链式反应技术、DNA芯片技术、ATP生物熒光技术、酶联免疫吸附技术等进行食品微生物检验。在检验过程中，必须树立无菌操作观念，规范无菌操作程序，在取样、样品前处理、纯种分离、革兰氏染色等过程中严格遵守无菌操作技术，顺利完成食品微生物检验工作，确保人群健康。
关键词：微生物检验 食品检验 快速检验技术 无菌操作技术
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2019）02（a）-0125-02
食品微生物污染与人体健康息息相关，采用先进技术进行准确、有效的检验有利于维护人群健康。传统微生物检验以染色、培养和生化鉴定等为主，结果比较可靠，为食品微生物检验的“金标准”。但细菌生长繁殖需要消耗一定时间，应及时检测;同时病原体培养还与营养、抗生素使用和病原体含量等因素相关。随着现代科学和物理化学、分子生物、免疫学等检验技术的不断发展，快速微生物检测技术被广泛应用。无菌操作是微生物检验的重要环节，在食品微生物检验时，检验人员必须树立无菌操作观念，规范无菌操作程序，才能顺利完成食品微生物检验工作。
1 食品微生物快速检验技术
1.1 阻抗法
微生物在培养基中生长繁殖会引起电特性变化，阻抗法是利用电变化特性来间接测定食品中微生物含量的一种检测技术，能够检测食品中绝大部分食品微生物。微生物能将培养基中的惰性大分子营养素分解为具有微电活性小分子物质，根据不同生长期微生物浓度与培养基电阻性之间的线性关系，通过培养基电阻抗的检测值可推算出食品样本微生物的浓度。
1.2 多聚酶链式反应技术（PCR）
该技术的基本原理是通过体外酶促反应高效合成特异性的双链DNA片断，之后通过扩增产物识别不同的细菌，由于在体外完成DNA片段扩增，故又称基因体外扩增法。
PCR技术具有较高的灵敏度，且耗费时间较短，理论上能检出一个细菌的拷贝基因，通过PCR技术在短时间增菌甚或不增菌的情况下即可筛选检测细菌。
PCR技术的缺点主要表现在：（1）出现假阴性结果。原因在于食物标本、增菌培养基和其他微生物DNA可能抑制Taq酶活性;（2）出现假阳性结果。PCR操作过程严格，微量外源性DNA混入食品样本可得到无限放大;（3）影响检测结果准确性，由扩增过程装配误差所致。
食品微生物检测可应用PCR全自动检测仪，这不仅可以克服手工操作的缺点，还能提高检测结果的敏感性和特异性。
1.3 DNA芯片技术
基因芯片技术具有广阔的发展前景和空间。生物芯片是基于玻片和尼龙膜等载体，有序排列很多生物活性分子。这些分子在单位面积上密度较高，在一次试验下就能同时检测多种食品样本及其中的多种病原微生物。
根据芯片固定生物活性分子的不同，可分为蛋白芯片和基因芯片两种类型，寡核苷酸探针或靶DNA为基因芯片的活性分子。与传统的检测方法相比，DNA芯片具有少样品需求、可快速准确高效地显示病原体遗传信息，已被广泛应用在分析宰基因序列、快速诊断病原微生物感染、研究变异和耐药机制、揭示发病机制以及感染性疾病的诊断和治疗等。
1.4 ATP生物荧光技术
ATP是一种高能磷酸化合物，含量相对稳定，普遍存在于各种细菌细胞中，并且是所有生物生命活动的最终能量来源。ATP生物荧光技术的原理是在荧光素酶的催化作用下，通过ATP激活荧光素并与氧结合，将化学能转化为光能，释放光量子。通过ATP不断提供能量，不断激活荧光分子，ATP浓度与发光强度呈线性关系。为降低外界干扰，增强特异性识别微生物能力，提高检测灵敏度和检测效率，应选取合适的ATP提取剂。
ATP生物荧光技术不需微生物培养，可在几分钟内得到检测结果，普遍应用于肉制品杂菌污染鉴定、饮料和调味品微生物检测等。
1.5 酶联免疫吸附技术
该技术是应用最广泛的酶免疫测定技术，其原理是在固相载体吸附抗原或抗体并行免疫酶染色，在酶作用下出现显色反应，之后运用定性或定量方法分析有色产物量，进而确定样品中待测物质的含量，是一种特异性和敏感性较高的食品微生物检测方法。
双抗体夹心法、间接法、捕获法、竞争法是常用的酶联免疫吸附技术，可用于检测食品中沙门氏菌、大肠杆菌、弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌等微生物，检测食品标本数量可达上千份，具有成本低、反应灵敏、适用范围广、定量和检测速度快等优势。
2 食品微生物检验的无菌操作技术
2.1 取样
食品微生物检验是无菌称取要求检验的样本质量，取样过程中要使用消毒天平，剪刀、药匙等检验用品要经170℃/2h干热灭菌。取样过程要严格按照无菌操作技术，切实保证样品原始状态。
2.2 样品前处理
取样后要行样品前处理，整个过程必须严格遵守无菌操作技术。一般称取25g样品于盛有225mL无菌稀释液无菌均质袋中均质，制备成1：10样品匀液进行检验。对计数样品要制备10倍系列稀释样品匀液，按照《食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB4789.2-2016）要求完成样品前处理操作。
2.3 纯种分离 为准确确定食品标本微生物群体，检验时要从混杂样品中分离出疑似目标菌，进而得到纯培养物。为促进目标微生物生长繁殖，要根据微生物不同特性针对性选择培养基并设定适宜培养条件;或通过应用相应抑制素，抑制除目标菌以外的杂菌生长繁殖，进而淘汰其他杂菌，进而将培养物接种在固体培养基上形成目标菌的单菌落。按要求纯化与鉴定单菌落，保证分离到纯菌株。
在整个分离纯化过程中，通常需要用接种环把微生物的纯培养物从一个器皿转接到另一个器皿中培养。如此时未严格遵守无菌操作技术，很难保证检验结果的准确性。同时，检验人员应加强自身实验水平与操作能力，确保无菌操作技术熟练准确，不断提高自身综合能力。
2.4 革兰氏染色
革兰氏染色是食品微生物确认鉴定的重要方法，将疑似目标菌经过纯化分离后染色，在光学显微镜下观察微生物形态，能初步鉴定微生物是否为所检验目标菌。涂片—初染—媒染—脱色—复染为革兰氏染色的操作步骤，涂片是最重要最关键的步骤，涂片过程中必须严格无菌操作技术，避免混入雜菌，影响镜检结果。
2.5 空白对照
按照GB4789.2-2016要求，在有营养琼脂培养基的灭菌培养皿中加入1mL空白稀释液作为空白对照，这是保证检验结果真实有效的关键措施。
空白对照结果可直接反映检验用品、无菌室空气条件和操作人员是否符合无菌操作的要求，即检验过程中所使用检验用品是否已彻底灭菌、无菌室空气条件是否满足既定标准、操作人员是否规范完成无菌操作技术。只有空白对照结果符合要求，才能获得可靠有效的检验结果。
综上所述，在食品质量检验过程中，要根据实际情况合理选用阻抗法、多聚酶链式反应技术、DNA芯片技术、ATP生物荧光技术、酶联免疫吸附技术等进行食品微生物检验。在检验过程中，必须树立无菌操作观念，规范无菌操作程序，在取样、样品前处理、纯种分离、革兰氏染色等过程中严格遵守无菌操作技术，顺利完成食品微生物检验工作，确保人群健康。
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