努比亚山羊BMPR-IB基因多态性与其产羔性状的关联分析

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　　摘要：【目的】明確努比亚山羊骨形态发生蛋白受体-IB（BMPR-IB）基因多态性与其产羔性状的关联，为山羊育种寻找新的遗传分子标记。【方法】采用DNA池结合PCR产物直接测序技术检测努比亚山羊BMPR-IB基因全部编码区的变异情况，以时间飞行质谱列阵技术对候选SNP位点进行基因分型，并分析BMPR-IB基因多态性与产羔性状（产羔数、初生重和断奶重）的关联性。【结果】努比亚山羊BMPR-IB基因5'UTR第469位存在A→G碱基突变，内含子1第1664位和内含子9第11344位处存在G→A碱基突变。3个SNP位点（5'UTR 469th、Intron1 1664th和Intron9 11344th）存在3种基因型（GG型、GA型和AA型），对应的多态信息含量（PIC）分别为0.37、0.11和0.37，其中Intron1 1664th位点的基因频率和基因型频率处于Hardy-Weinberg平衡状态（P?0.05），5'UTR 469th和Intron9 11344th位点则处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）。关联分析结果表明，努比亚山羊BMPR-IB基因5'UTR第469位碱基由A→G，其GG型母羊比AA型母羊的产羔数和子代平均初生重有所减少，但子代平均断奶重增加;内含子1第1664位碱基由G→A，其GA型母羊比GG型母羊的产羔数和子代平均初生重均有所增加，但子代平均断奶重减轻;内含子9第11344位碱基由G→A，其AA型母羊比GG型母羊产羔数少，但子代平均初生重和平均断奶重均增加。可见，努比亚山羊BMPR-IB基因的3个SNP位点对其产羔性状均无显著影响（P>0.05）。【结论】努比亚山羊BMPR-IB基因存在3个SNP位点（5'UTR 469th、Intron1 1664th和Intron9 11344th），但对努比亚山羊产羔性状影响不显著，说明BMPR-IB基因对山羊的产羔性状具有一定种属特异性。
　　关键词： 努比亚山羊;BMPR-IB基因;SNP位点;产羔性状;多态性;关联分析
　　中图分类号： S827.92                                 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）04-0860-07
　　Abstract：【Objective】The correlation between Nubian goat bone morphogenetic protein receptor-IB（BMPR-IB） gene polymorphism and its lambing traits was clarified to search new genetic molecular markers related to goat breeding. 【Method】In this study， DNA pool and PCR products sequencing technique were used to detect the variation of whole coding region of Nubian goat BMPR-IB gene. Time flight mass spectrometry was applied to perform the genotype of candidate SNP loci， and analyze the relationship between polymorphism of BMPR-IB gene and goat lambing traits（lamb number， primary weight and weaning weight）. 【Result】There was a G→A base mutation at the 469th position of 5'UTR of BMPR-IB gene of Nubian goat， a G→A base mutation at the 1664th position of intron 1 and the 11343th position of intron 9. The three SNP loci（5'UTR 469th， Intron1 1664th and Intron9 11344th） had three genotypes（GG type， GA type and AA type）， the polymorphic information content（PIC） respectively were 0.37， 0.11 and 0.37. The gene frequency and genotype frequency of Intron1 1664th were in Hardy-Weinberg equilibrium state（P?0.05）， 5'UTR 469th and Intron9 11344th were in Hardy-Weinberg imbalance（P<0.05）. Correlation analysis showed that the 5'UTR 469th base of the BMPR-IB gene of Nubian goat was A→G， which resulted in a reduction of the lamb number and the average primary weight of the lamb in GG ewes compared with the AA ewes，but increase of the average weaning weight of the offspring. Intron1 1664th base was mutated from G to A， while the lamb number and the average primary weight of the GA ewes were higher than those of the GG ewes， but the average weaning weight of the offspring was reduced. Intron9 11344th base was mutated from G to A. The AA type ewes had fewer lambs than the GG ewes， and their offspring’s average primary weight and average weaning weight increased.The three SNP loci of BMPR-IB gene of Nubian goat had no significant effects on its lambing traits（P>0.05）. 【Conclusion】There are three SNP loci in the BMPR-IB gene of Nubian goats（5'UTR 469th， Intron1 1664th and Intron9 11344th）， but the effect on the lamb traits of Nubian goats is not significant， indicating that the BMPR-IB gene has species specificity on lamb traits for goats. 　　Key words： Nubian goat; BMPR-IB gene; SNP locus; lambing trait; polymorphism; association analysis
　　0 引言
　　【研究意义】山羊产羔性状与其群体的繁衍速度和规模密切相关，是影响养羊业经济效益的重要因素。骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）是20世纪60年代发现的一个受体蛋白，可与骨形态发生蛋白受体（Bone morphogenetic protein receptor，BMPR）结合，诱导胚胎腹侧中胚层、软骨和骨的形成，具有调节细胞增殖分化、迁移凋亡、细胞支持及胚发育等生物功能（邹辉等，2018）。骨形态发生蛋白受体-IB（Bone morphogenetic protein receptor-IB，BMPR-IB）是一种重要的跨膜受体蛋白，主要参与转化生长因子β通路，在调控成骨分化、细胞扩散及卵巢卵泡发育等过程中发挥重要作用，并直接影响绵羊等动物的繁殖性状（孙红霞等，2009;邵勇钢等，2012）。因此，筛选出BMPR-IB基因的分子标记对提高山羊产羔性能具有重要意义。【前人研究进展】BMPR-IB是转化生长因子B（Transforming growth factor B，TGFB）超家族中的一员（Dash et al.，2018），属于TGF-β家族的I型受体，编码一个转移生长因子β亚基（TGFβ）受体家族成员（焦丹等，2016）。BMPR-IB基因是多种骨形态发生蛋白的膜受体基因，在动物输卵管、骨骼肌、肾脏、下丘脑、子宫、骨骼、垂体、脊髓、耳和卵巢中的表达量逐渐升高（王小佳等，2017），参与调节颗粒细胞生长和分化、促进卵泡发育及增加卵泡数目，与卵母细胞上的生长因子、GDF9和BMP15共同影响动物的繁殖性能（Vacca et al.，2010）。已有研究证实，BMPR-IB基因敲除、沉默及其多态性均与动物排卵数等繁殖性能相关（Rodriguez et al.，2016）。绵羊BMPR-IB基因位于第6号染色体上，其mRNA序列全长3255 bp，DNA序列全长225039 bp，含有12个外显子和11个内含子（李闯等，2018）。BMPR-IB基因第8外显子存在1个FecB（Fecundity booroola）突变（A746G），导致第249位氨基酸由谷氨酰胺突变成精氨酸（Gln→Arg），该突变对绵羊排卵数有加性效应，对产羔数呈部分显性效应，每增加1个拷贝将多排卵1.65枚;BMPR-IB基因除存在FecB突变位点外，还存在其他突变位点（姚雅馨，2017）。Souza等（2001）研究发现，C1113A突变导致出现大量小型有腔卵泡早熟、排卵率增加等表型特征，同时发现20个新的突变位点，其中3个突变位点（G922T、T1043C和G192T）导致氨基酸改变，但未影响产羔数。孙红霞等（2009）、邵勇钢等（2012）分别以小尾寒羊、蒙古羊和策勒黑羊为研究对象，发现BMPR-IB基因可能是控制小尾寒羊和滩羊多胎性能的主基因;但Chu等（2012）研究济宁青山羊、文登奶山羊和蒙古绒山羊外显子1、外显子2、外显子6、外显子10和3'UTR的多态性时发现，BMPR-IB基因检测出的突变位点对产羔数无显著影响。李文杨等（2012）、刘远等（2012a，2012b）分别采用PCR-RFLP对戴云山羊、闽东山羊、福清山羊和南江黄羊BMPR-IB基因进行SNP位点检测，也未发现影响产羔数的碱基突变。Wang等（2015）研究发现，小尾寒羊和湖羊的BMPR-IB基因均存在3个突变位点（A746G、C718T和C47T），且对产羔数有一定影响，表明BMPR-IB基因可作為产羔性状的遗传分子标记。可见，要明确BMPR-IB基因对产羔数的影响是否具有种属或品系特异性，还需进一步对更多数量和种类的羊群进行研究。【本研究切入点】目前，关于BMPR-IB基因对动物繁殖性状的遗传效应研究已有很多报道，但该基因在努比亚山羊产羔性状中的研究较少。【拟解决的关键问题】采用DNA池结合PCR产物直接测序技术检测努比亚山羊BMPR-IB基因全部编码区的变异情况，以时间飞行质谱列阵技术对候选SNP位点进行基因分型，并对BMPR-IB基因多态性与产羔性状（产羔数、初生重和断奶重）进行关联分析，以期为山羊育种寻找新的遗传分子标记。
　　1 材料与方法
　　1. 1 试验材料
　　努比亚山羊母羊血液均采自广西扶绥广羊畜牧养殖有限公司;DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，PCR扩增试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，琼脂糖和DL2000 DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司。
　　1. 2 引物设计与合成
　　根据山羊BMPR-IB基因序列，采用Oligo 7.0设计扩增BMPR-IB基因片段序列的引物（表1），所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
　　1. 3 DNA提取
　　根据血液DNA提取试剂盒说明，提取240只努比亚山羊母羊血液基因组DNA。然后取1.5 ?L提取的DNA，采用分光光度计检测OD260/OD280。根据OD260/OD280预测DNA纯度，纯品DNA的OD260/OD280为1.6～1.9;再以1.5%琼脂糖凝胶电泳检验DNA， -40 ℃保存备用。
　　1. 4 基因片段检测及DNA池测序
　　PCR反应体系30.0 ?L：2×Taq Master Mix 15.0 ?L，上、下游引物各1.0 ?L，DNA模板2.0 ?L，ddH2O补足至30.0 ?L。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 2 min，进行35个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。分别取5.0 ?L PCR扩增产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。从有效PCR扩增产物中各挑选3管进行片段测序，测序结果与NCBI上的参考序列进行BLAST比对分析。将提取的260管DNA（50 ng/?L）分成13个组，每组20管（按序号依次编排），然后从每组20管DNA中取出0.5 ?L混在1个离心管中，混匀，即为1个混合池，共产生13个DNA混合池。以混合池DNA为模板对努比亚山羊BMPR-IB基因的全部外显子进行扩增及测序分析。 　　1. 5 多态性位点（SNP）基因分型
　　采用MassARRAY时间飞行质谱列阵对SNP位点进行基因型检测，并针对这些SNP位点设计相应的引物进行时间飞行质谱基因分型，基因分型的引物见表2。
　　1. 6 遗传学分析
　　基于基因序列测序结果，计算不同SNP位点在努比亚山羊母羊群体中的基因型频率、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、有效等位基数（Ne）、多态信息含量（PIC）及Hardy-Weinberg平衡等遗传学参数。
　　1. 7 统计分析
　　基因序列测序结果用DNASTAR、MegALign和SAS 9.0进行统计分析。
　　2 结果与分析
　　2. 1 努比亚山羊血液DNA提取结果
　　提取的努比亚山羊血液DNA样品通过分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测，其浓度和纯度均符合要求，获得的条带清晰单一（图1），可供后续研究使用。
　　2. 2 努比亚山羊BMPR-IB基因片段DNA池检测结果
　　以提取的努比亚山羊血液DNA混合池为模板进行PCR扩增，扩增获得的BMPR-IB基因片段大小均与预期结果一致（图2），经DNA池序列分析发现，努比亚山羊BMPR-IB基因5'UTR第469位存在A→G碱基突变，内含子1第1664位和内含子9第11344位存在G→A碱基突变（图3）。
　　2. 3 努比亚山羊BMPR-IB基因SNP位点的基因分型及其遗传学分析结果
　　利用MassARRAY时间飞行质谱列阵检测3种不同基因型（GG、GA和AA）的分布情况，结果发现3种不同基因型的样品在分型时分别在3个区域密集分布（图4），仅个别样品因偏离检测轨道而无法检测出其基因型，绝大部分样品的检测结果在正常轨道上，能很好地区分出基因型，保证分型结果的准确性。
　　一般情况下，PIC<0.25为低度多态，0.25<PIC<0.50为中度多态，PIC>0.50为高度多态。由表3可知，5'UTR 469th和Intron9 11344th位点的PIC均为0.37，属于中度多态;Intron1 1664th位点的PIC为0.11，为低度多态。此外，Intron1 1664th位点的Ho较高，缺少AA基因型个体，5'UTR 469th和Intron9 11344th位点的Ho和He较适中，均接近0.50。
　　从表4可看出，Intron1 1664th位点在努比亚山羊群体中的基因频率和基因型频率均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P?0.05），而5'UTR 469th和Intron9 11344th位点的基因频率和基因型频率则处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05），可能是在日常饲养及育种过程中经过人为选择的结果。
　　2. 4 努比亚山羊BMPR-IB基因SNP位点与其产羔性状的关联性
　　BMPR-IB基因对努比亚山羊产羔性状（产羔数、初生重和断奶重）的关联分析采用固定模型Yi=μ+Gi+ei。式中，Yi为产羔性状记录值;μ为群体均值;Gi为基因型效应;ei为随机残差效应。采用SAS 9.0中的GLM过程对不同BMPR-IB基因SNP位点与产羔数、初生重和断奶重的相关性进行分析。结果（表5）表明，努比亚山羊BMPR-IB基因5'UTR第469位碱基由A→G，其GG型母羊比AA型母羊的产羔数和子代平均初生重有所减少，但子代平均斷奶重增加;内含子1第1664位碱基由G→A，其GA型母羊比GG型母羊的产羔数和子代平均初生重均有所增加，但子代平均断奶重减轻;内含子9第11344位碱基由G→A，其AA型母羊比GG型母羊产羔数少，但子代平均初生重和平均断奶重都增加。由表5可知，努比亚山羊BMPR-IB基因的3个SNP位点对其产羔性状均无显著影响（P>0.05）。
　　3 讨论
　　BMPR-IB基因是影响动物繁殖性状的重要基因（潘章源等，2015）。Mahdavi等（2014）采用RFLP-PCR检测发现Kalehkoohi绵羊FecB基因BB型和B+型的羊产羔数分别较++型的多0.52和0.35只;Miao等（2016）通过全基因组转录组分析得出BMPR-IB基因与山羊的繁殖力关系密切。BMPR-IB基因在山羊上的研究已有较多报道，并获得一些实用的分子标记投入生产实践。Wang等（2015）研究发现小尾寒羊和湖羊的BMPR-IB基因均存在3个突变位点（A746G、C718T和C47T），且对产羔数有一定影响，表明BMPR-IB基因可作为产羔性状的遗传分子标记;但Chu等（2012）研究发现济宁青山羊、文登奶山羊和蒙古绒山羊BMPR-IB基因的突变位点对产羔数无显著影响，李文杨等（2012）在戴云山羊、闽东山羊、福清山羊和南江黄羊上也未发现影响产羔数的BMPR-IB基因突变。本研究结果表明，努比亚山羊BMPR-IB基因的3个SNP位点对其产羔性状均无显著影响，说明BMPR-IB基因对山羊的产羔性状具有一定种属特异性。
　　DNA混合池检验SNP位点和时间飞行质谱列阵基因分型是一种成熟且实用的技术（李隐侠等，2017）。本研究以努比亚山羊血液为材料，提取的DNA经浓度调节后确保在制备DNA混合池时各组分浓度相近，不会出现因浓度不均而引起的误差。经DNA混合池PCR测序发现，努比亚山羊BMPR-IB基因存在3个SNP位点，且这3个SNP位点的叠峰部分均在90%以上，说明其多态性较明显，也证实本研究的试验方法可行可靠。本研究在努比亚山羊BMPR-IB基因片段上发现3个SNP位点，但这些SNP位点的变异对努比亚山羊产羔性状影响不显著，可能是所采集血液样品上存在数据结构上的特异性，也有可能是SNP位点的遗传效应具有种属效应。因此，本研究虽然得出BMPR-IB基因上的SNP位点对努比亚山羊产羔性状影响不显著，但并不能说明该位点对山羊的产羔性状没有影响，而需进一步对BMPR-IB基因进行研究。 　　4 結论
　　努比亚山羊BMPR-IB基因存在3个SNP位点（5'UTR 469th、Intron1 1664th和Intron9 11344th），但对努比亚山羊产羔性状影响不显著，说明BMPR-IB基因对山羊的产羔性状具有一定种属特异性。
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　　（責任编辑 兰宗宝）
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