前体调控对Bacillus sp. 108菌株发酵合成抑制 甘蔗鞭黑粉菌活性物质产量的影响

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　　摘要：【目的】研究前體调控对Bacillus sp. 108菌株发酵合成抑制甘蔗鞭黑粉菌活性物质24元大环内酯产量的影响，为Bacillus sp.108菌株发酵工艺规模化放大及甘蔗黑穗病的防治提供新途径。【方法】利用单因素优化方法，考察乙酸钠、丙酸钠、正丙醇、异亮氨酸和缬氨酸对Bacillus sp. 108菌株发酵合成24元大环内酯的作用，确定有效前体的最佳添加浓度和添加时间;采用平板对峙法测定Bacillus sp. 108菌株发酵产物24元大环内酯对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用。【结果】乙酸钠是Bacillus sp. 108菌株发酵合成24元大环内酯的最佳前体，在发酵第96 h时添加1.0%乙酸钠，24元大环内酯的产量达104.45 μg/mL，比未添加前体发酵的对照组提高58.74%。Bacillus sp. 108菌株发酵粗提物对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长具有较强的抑制作用，半数有效浓度（EC50）0为157.94 μg/mL。【结论】乙酸钠是Bacillus sp.108菌株发酵合成24元大环内酯较适宜的前体物质，24元大环内酯对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长具有明显的抑制作用，具有开发成微生物农药的潜力。
　　关键词： 海洋芽孢杆菌;24元大环内酯;发酵;前体;甘蔗鞭黑粉菌
　　中图分类号： S435.661                                 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）04-0755-06
　　Abstract：【Objective】The effects of precursor regulation on the inhibition of the production of active substances of Sporisorium scitamineum by Bacillus sp. 108 fermentation and synthesis was studied， which provided a new way for the scale-up of Bacillus sp. 108 fermentation process and the prevention and control of sugarcane smut. 【Method】The effects of sodium acetate， sodium propionate， n-propanol， isoleucine and valine on the fermentation of Bacillus sp. 108 strain to synthesize 24-membered macrolide were investigated by single factor optimization method， and the optimum concentration and adding time of effective precursors were determined. The inhibition effect of Bacillus sp. 108 strain fermentation products 24-membered macrolide on S. scitamineum was determined by plate confrontation method. 【Result】Sodium acetate was the optimal precursor for 24-membered macrolide biosynthesis by Bacillus sp. 108 strain. By feeding of 1.0% sodium acetate into the fermentation broth at the 96th h of cultivation， the 24-membered macrolide production was 104.45 μg/mL， 58.74% higher than that in the control without any addition of precursor. The mycelium growth experiment of S. scitamineum showed that extract of Bacillus sp. 108 strain fermentation products could inhibit the growth of S. scitamineum mycelium， the median effective concentration（EC50） values was 157.94 μg/mL. 【Conclusion】Sodium acetate is suitable precursor for 24-membered macrolide biosynthesis by Bacillus sp. 108 strain fermentation. The study confirms that 24-membered macrolide has an inhibitory effect on the growth of the mycelium of S. scitamineum， and has the potential to be developed into a microbial pesticide.
　　Key words： Bacillus marinus; 24-membered macrolide; fermentation; precursor; Sporisorium scitamineum 　　0 引言
　　【研究意义】甘蔗黑穗病是制约甘蔗产业发展的重要病害之一（Schenck et al.，2005），由甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）引起。甘蔗一旦感染黑粉菌，会造成生长点变异，产生黑色鞭状物，从而导致甘蔗产量和产糖量下降（Su et al.，2013）。广西中医药大学海洋药物研究院在前期研究中已筛选获得对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的生防菌株Bacillus sp. 108，但其抑菌活性物质产量仅为63.78±1.34 μg/mL（余炼，2016;江蕾，2018），难以满足后续药理学应用和作用机制的进一步研究。因此，对生防菌株Bacillus sp. 108抑菌活性物质的合成途径进行研究，以期大幅提高抑菌活性物质的产量，对于甘蔗黑穗病的防治具有重要意义。【前人研究进展】抑菌活性物质的产量主要由活性菌株的遗传特性、培养工艺及反应器的操作性能等因素决定。在发酵工艺优化方面，通过添加外源性前体物质强化微生物的生物合成过程，可使代谢途径沿目标产物合成方向进行（高春霞，2018）。陈海燕和郭鸿雁（2013）研究了丙酸钠作为前体物质的最佳添加浓度和添加时间，发现在发酵48 h时添加浓度为10 mmol/L的丙酸钠，阿维菌素产量可达5157.89 μg/mL，比未添加前体物质处理提高104.84%;陈慎等（2017）采用固态培养发酵方式，选取不同浓度的乙酸钠、乙醇、丙酸钠、丁酸钠、柠檬酸三钠、柠檬酸铁、柠檬酸铁铵和琥珀酸钠作为前体物质加入培养基进行发酵，结果表明0.1%柠檬酸三钠在提高Monacolin K和洛伐他汀含量上作用明显;方舟等（2018）在发酵培养基中添加4种前体物质，其中大豆油对纽莫康定B0效价的影响极显著，尤其在大豆油6.0 g/L、亮氨酸1.0 g/L、异丁醇4.0 ml/L、甲硫氨酸0.3 g/L时纽莫康定B0发酵单位达1295 mg/L左右;周剑和张引（2018）将癸酸铵作为前体物质，通过对发酵方式进行优化，即在发酵30 h后以4.0 mL/（L·h）恒速流加入5%癸酸铵溶液的方式，可使达托霉素发酵效价达2276 mg/L。【本研究切入点】余炼（2016）通过UPLC-MS分析发现对甘蔗鞭黑粉菌有抑制作用的菌株Bacillus sp. 108的发酵粗提物与24元大环内酯的离子碎片相似度较高，推断该类化合物为一类结构相似的24元大环内酯。但目前提高Bacillus sp. 108菌株次级代谢物24元大环内酯产量的方法多见于菌种诱变、发酵工艺条件优化等，关于通过生物合成途径提高24元大环内酯产量的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以海洋芽孢杆菌Bacillus sp. 108发酵产24元大环内酯的产量为研究对象，采用单因素试验方法优化前体添加条件，并以平板对峙法测定24元大环内酯对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果，为Bacillus sp. 108菌株发酵工艺规模化放大及甘蔗黑穗病的防治提供新途径。
　　1 材料与方法
　　1. 1 试验材料
　　1. 1. 1 菌种 供试生防菌株由广西中医药大学海洋药物研究院于广西防城港怪石滩（东经108°22′、北纬21°49′）水下5 m分离获得，经形态特征分析及16S rRNA测序比对，鉴定并命名为Bacillus sp. 108。
　　供试病原菌菌株：由广西中医药大学海洋药物研究院于发病甘蔗植株上分离得到的甘蔗鞭黑粉菌冬孢子。
　　1. 1. 2 培养基 纯化及保藏培养基：改良ISP2固体培养基;发酵培养基：改良ISP2液体培养基;指示菌培养基：PDA培养基。
　　1. 1. 3 主要仪器设备 JJ1000Y型电子天平（上海仁沃实业发展有限公司）、SW-CJ-2F型洁净工作台（苏州亿达净化设备有限公司）、Avanti J-E多功能高效离心机（美国Beckman Coulter公司）、N-1000型旋转蒸发器（上海爱朗仪器有限公司）、HVE-50型高压灭菌锅（日本HIRAYMA公司公司）、DHP-9162电热恒温培养箱（上海天呈科技有限公司）、Waters e2695分析半制备型高效液相色谱仪（美国Waters公司）、XB-C18型分析柱（4.6 mm×250 mm）。
　　1. 2 試验方法
　　1. 2. 1 菌种培养 菌种平板培养：用划线方法将Bacillus sp. 108菌株孢子接种到培养基上，28 ℃恒温培养。生长1 d后可观察到菌落形态平坦，分布稀疏，呈白灰色;3 d后菌落沿划线方向生长，无渗出液，呈淡黄色;第5 d菌落长满划线区域，判定孢子成熟，可进行下一步的发酵培养。
　　摇瓶种子培养：取2环经活化的菌种接种至装有200 mL培养基的500 mL三角瓶中，28 ℃下摇床（180 r/min）培养10 h。
　　1. 2. 2 前体物质种类对24元大环内酯生物合成的影响 分别向发酵培养基中以0.1%（w/v）的添加量加入乙酸钠、丙酸钠、正丙醇、异亮氨酸和缬氨酸，以筛选出对Bacillus sp. 108发酵合成24元大环内酯具有促进作用的前体物质，以未添加前体物质的基础发酵培养基为对照。发酵7 d（168 h）后取样测定发酵液中24元大环内酯化合物产量及菌体干重（生物量）。
　　1. 2. 3 最佳添加浓度对24元大环内酯生物合成的影响 在配制发酵培养基时，分别向培养基中添加0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%和1.2%的最适前体，以未添加前体的基础发酵培养基为对照。发酵7 d后取样测定分析，确定最适添加浓度。
　　1. 2. 4 最佳添加时间对24元大环内酯生物合成的影响 分别在发酵培养的第0、24、48、72、96、120和144 h向发酵培养基加入最适浓度的最佳前体，以未添加前体的基础发酵培养基为对照。发酵7 d后取样测定分析，确定最佳添加时间。 　　1. 2. 5 活性菌株发酵及其粗提物的制备 参照覃媚等（2016）的方法，发酵结束后收集发酵液并进行破壁处理，用乙酸乙酯等体积萃取4次，浓缩回收乙酸乙酯后得到细菌发酵粗提物，并置于干燥器低温保存。
　　1. 2. 6 发酵粗提物乙酸乙酯相的高效液相色谱（HPLC）分析 参考Xue等（2008）和Mojid Mondol等（2011）的方法，选用Waters e2695分析半制备型高效液相色谱，4.6 mm×250 mm Waters XB-C18型分析柱。操作条件：流动相为色谱级甲醇（A）和超纯水（B）;洗脱条件0～5 min，5%甲醇;5～35 min，95%甲醇;35～46 min，100%甲醇;46～52 min，5%甲醇;流速1 mL/min;进样量5 μL;检测波长227 nm。根据标准曲线（y=1774x+279674）计算得到产物含量（μg/mL），其中x表示大环内酯产量，y表示峰面积。
　　1. 2. 7 24元大环内酯杀菌剂对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长的抑制作用 参照Singh等（2005）的方法检测24元大环内酯对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。首先用生物级DMSO将24元大环内酯配成含量为1000.0、100.0、50.0、10.0、5.0、1.0和0.1 μg/mL系列浓度的母液，然后分别加入到25 mL灭菌后冷却至50 ℃的PDA固体培养基中，摇匀后倒入灭菌培养皿，制成24元大环内酯的系列浓度含药培养基。再用牙签挑取“+”、“-”两种配型的甘蔗鞭黑粉菌担孢子，分别接种于装有50 mL YEPS培养基的三角瓶中，设摇床培养条件为28 ℃、180 r/min，培养36～48 h;将两种配型担孢子菌悬液等体积比例混合后，用移液枪吸取1 μL混合菌悬液，分别滴加到含有不同浓度24元大环内酯的PDA培养基上，以不含24元大环内酯的PDA培养基为阳性对照。静置待平板内的悬浮液完全吸干，倒置平板放入培养箱继续培养7 d，每种浓度设3次平行。培养结束后用十字交叉法测量不同24元大环内酯浓度下的菌落直径，计算24元大环酯对甘蔗鞭黑粉菌的半数有效浓度（EC50）。
　　2 结果与分析
　　2. 1 前体调控对24元大环内酯生物合成的影响
　　2. 1. 1 不同前体对24元大环内酯生物合成的影响 由图1可知，添加0.1%乙酸钠可有效提高24元大环内酯发酵产量及菌体干重，总大环内酯产量达68.97 μg/mL，比对照（65.80 μg/mL）提高4.82%，菌体生物量也比对照高30.83%。推测是乙酸钠参与了Bacillus sp. 108液态发酵合成24元大环内酯的代谢途径，且对其合成起促进作用;正丙醇和缬氨酸对24元大环内酯合成的影响不明显，而丙酸钠和异亮氨酸会抑制24元大环内酯合成。Schneider等（2007）的前体补料试验结果表明，大环内酯类物质是通过聚酮途径以甲基丙二酰CoA为起始和延伸单元组装而成。因此，24元大环内酯的合成途径与典型的大环内酯类物质的生物合成途径并不完全相同，丙酸盐类的前体物质并不一定能提高24元大环内酯类物质发酵效率。此外，刘扬等（2014）研究发现微生物中次级代谢物的生物合成基因通常受多个水平和多层次的调控，丙二酰CoA为聚酮合酶的延伸单位，经11轮的Claisen缩合及聚酮链末端的羟基对羰基碳进行亲核攻击，再通过Aldol Reaction反应才环化形成大环内酯类物质。据此选择乙酸钠为前体进行最适添加浓度及添加时间试验。
　　2. 1. 2 乙酸钠添加浓度对24元大环内酯生物合成的影响 配制发酵培养基时向培养基添加不同浓度乙酸钠，发酵7 d后取样测定菌体干重及24元大环内酯产量。结果（图2）显示，当发酵培养基中乙酸钠添浓度从0.1%增加到1.0%时，24元大环内酯产量和发酵液生物量随之上升，说明在合适的浓度条件下，乙酸钠能有效促进菌体生长和产物合成;但当乙酸钠浓度超过1.0%时24元大环内酯产量和菌体干重明显下降。究其原因，一是培养基中乙酸钠浓度可能过高，使得菌体在长时间低pH环境下生长受到抑制，影响24元大环内酯在体外的合成;二是前体一般都有毒性，高浓度乙酸钠对菌体的生长不利，导致24元大环内酯产量下降，而且前體物质的价格相对较高，添加过多也易引起挥发和氧化。因此，确定前体乙酸钠的最佳添加量浓度为1.0%，此条件下24元大环内酯产量最高，达84.68 μg/mL，比空白对照（63.65 μg/mL）提高33.04%。
　　2. 1. 3 乙酸钠添加时间对24元大环内酯生物合成的影响 在不同发酵时期，菌体的生长情况不相同，而24元大环内酯作为菌株的发酵产物，其合成程度也有所不同。由图3可知，在发酵培养第96 h添加1.0%乙酸钠，24元大环内酯产量及菌体干重均比其他处理组效果好，24元大环内酯产量达104.45 μg/mL，与对照相比提高58.74%。其原因可能是在培养0～48 h时加入乙酸钠，由于细胞合成的功能酶还较少，没有足够的物质调节代谢转换，因而前期添加乙酸钠细胞对其利用率较低;在发酵培养第72～96 h是菌体开始进入次级代谢产物大环内酯合成阶段，此时加入乙酸钠能作为前体参与合成大环内酯;在发酵培养第120 h加入乙酸钠，细胞受到前体作用的时间短，有部分细胞未能及时转化成大环内酯而发酵过程已结束，未能充分利用乙酸钠。因此，在发酵培养第96 h加入1.0%乙酸钠能促进24元大环内酯的合成。
　　2. 2 24元大环内酯对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长的抑制效果
　　由表1和图4可知，各24元大环内酯浓度处理对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长均有抑制作用，24元大环内酯浓度越高，对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长的抑制效果越强，且均优于阳性对照，EC50为157.94 μg/mL。因此，Bacillus sp. 108菌株的主体代谢产物24元大环内酯具有开发成生物农药用于防控甘蔗黑穗病的潜力。 　　3 讨论
　　近年来，生物防治以其生态环境友好、成本低及无污染的特点已成为植物病害防治的热门研究领域，其中芽孢杆菌因其生长速度快、耐受性良好、抑菌作用广泛而成为科研工作者生防研究的热点（Wang et al.，2015;段海明等，2017;王波等，2017;何碧珀等，2018）。江蕾等（2018）采用牛津杯法对来自海黄瓜的79株共附生细菌的发酵产物进行抗甘蔗鞭黑粉菌活性测定，结果发現芽孢杆菌属细菌BGMRC03005对3种鞭黑粉菌形态均有抑制作用。李菲等（2018）利用牛津杯法对来自广西斜阳岛附近海域的24株海绵共附生细菌进行抑制甘蔗鞭黑粉菌活性筛选，发现有8株细菌的发酵粗提物对甘蔗鞭黑粉菌具有很强的抑菌活性，其中4株隶属于芽孢杆菌属。有些酶，如β-葡聚糖酶、几丁质酶和分泌糖蛋白等是通过水解菌丝体细胞壁的一些成分来抑制甘蔗鞭黑粉菌冬孢子萌发。王竹青（2016）将甘蔗鞭黑粉菌接种在1个抗病品种（YZ03/258）和1个易染病品种（FN39）的蔗芽上，测定其在0～7 d的生理生化指标，结果发现两个品种的过氧化物酶（POD）活性均持续上升，但抗病品种的POD活性比易染病品种的增幅大，表明POD有利于甘蔗抵抗黑粉菌的入侵。
　　本研究发现Bacillus sp. 108发酵代谢合成的24元大环内酯对甘蔗鞭黑粉菌具有良好的抑菌活性，且24元大环内酯浓度越高，对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长的抑制效果越强，EC50为157.94 μg/mL。在大环内酯类抗生素的生物合成中，内酯环是基于乙酸、丙酸和丁酸盐等而形成。这意味着大环内酯类抗生素的生物合成重要前体是短链脂肪酸，但由于乙酸和丙酸等脂肪酸前体对菌丝体有一定的毒性，不利于菌体生长，因而限制了大环内酯类抗生素的生物合成。因此，本研究将乙酸钠、丙酸钠、正丙醇、异亮氨酸和缬氨酸作为外源性前体，在发酵过程中加入发酵培养基，使其参与24元大环内酯的生物合成，筛选出在发酵第96 h添加1.0%乙酸钠是对Bacillus sp. 108发酵合成24元大环内酯具有促进作用的前体物质。这与多拉菌素（杨世红等，2011）和阿维菌素（樊乐，2017）类大环内酯的生物合成途径不完全相同，说明丙酸盐类的前体物质并不一定都能提高24元大环内酯发酵效率。
　　本研究虽然通过外加前体物质提高了Bacillus sp. 108发酵产24元大环内酯产量，并通过观察菌丝生长情况验证其对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用，但其生产发酵仍停留在实验室规模的基础上。因此，在后续的研究中应通过研究Bacillus sp. 108发酵动力学，建立底物消耗与24元大环内酯物质合成及菌体生长的关系方程，通过改变底物浓度及控制菌体生长来提高24元大环内酯产量，还可以该产物的药学性质为研究对象，为对甘蔗黑穗病有防治作用的新型生物农药开发提供理论基础。
　　4 结论
　　乙酸钠作为前体对Bacillus sp. 108菌株发酵合成24元大环内酯的促进作用优于丙酸钠、正丙醇、异亮氨酸和缬氨酸，是较适宜的前体物质。对Bacillus sp. 108菌株发酵粗提物活性物质的进一步研究发现，24元大环内酯对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长有明显的抑制作用，表明Bacillus sp. 108菌株具有开发成生物农药用于防控甘蔗黑穗病的潜力。
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　　（責任编辑 麻小燕）
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