基于AOTF—近红外光谱技术的六味地黄胶囊快速质量控制方法研究

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　　摘 要 目的：建立六味地黃胶囊快速无损的质量控制方法。方法：利用声光可调滤光器（AOTF）-近红外（NIR）光谱技术。以某厂家近3年生产的80批六味地黄胶囊为样本，采用高效液相色谱法测定其中马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷、熊果酸的含量，并按2015年版《中国药典》（一部）通则方法测定其中水分含量。随后，应用The Unscrambler定量分析软件，以70批样品组成校正集样品，采用偏最小二乘法和交叉-验证法分别建立六味地黄胶囊中上述6个指标的NIR定量模型；并以剩余10批样品为验证集样品，对模型进行外部验证。结果：所建立的马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷、熊果酸、水分定量模型内、外部验证相关系数（R2）均大于0.9，校正标准偏差（RESEC）分别为0.372 8、0.025 4、0.263 3、0.288 5、0.186 7、0.037 7；预测标准偏差（RESEP）分别为0.462 2、 0.077 5、0.472 1、0.634 9、0.293 4、0.206 9。外部验证结果显示，各指标预测值与真实值的平均偏差分别为6.04%、6.05%、5.87%、6.97%、5.62%、4.83%，均小于10%。结论：建立的方法可实现六味地黄胶囊质量的快速、无损分析。
　　关键词 声光可调滤光器-近红外光谱技术；六味地黄胶囊；质量控制；马钱苷；莫诺苷；丹皮酚；芍药苷；熊果酸；水分
　　Methodology Study on Rapid Quality Control of Liuwei Dihuang Capsule by AOTF-near Infrared Spectroscopy
　　BIAN Yu1，JIANG Wenyue1，WANG Meihui1，REN Xuhua1，QU Jiale1，LI Min2，GAO Lu1（1.Jilin Modern Chinese Medicine Engineering and Research Center Co.， Ltd.， Changchun 130012， China；2.Xiuzheng Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Jilin Tonghua 134001， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for the rapidly non-destructive quality control of Liuwei dihuang capsule. METHODS： AOTF-NIR spectrometry was adopted. Taking 80 batches of Liuwei dihuang capsule produced by a manufacturer in recent three years as samples， HPLC chromatogram was adopted to determine the contents of loganin， morroniside， paeonol， paeoniflorin and ursolic acid； the content of water was determined according to general principles stated in 2015 edition of Chinese Pharmacopeia （part Ⅰ）. Taking 70 batches of samples as correction set， the partial least square method and the cross-validation algorithm were used to establish the NIR quantitative model of 6 indexes in Liuwei dihuang capsules with the Unscrambler quantitative analysis software. Taking residual 10 batches of samples as validation set， external validation was conducted for the model. RESULTS： The correlation coefficients （R2） of internal and external validation of loganin， morroniside， paeonol， paeoniflorin， the content of water quantitative model were all greater than 0.9； the correction of standand deviation （RMSEC） were 0.372 8， 0.025 4， 0.263 3， 0.288 5， 0.186 7 and 0.037 7； the prediction of standard deviation （RMSEP） were 0.462 2， 0.077 5， 0.472 1， 0.634 9， 0.293 4 and 0.206 9； the external verification showed that mean deviations of preclicted value to actual value were 6.04%， 6.05%， 5.87%， 6.97%， 5.62% and 4.83%， with the mean deviation less than 10%.CONCLUSIONS：The established method can achieve rapidly non-destructive analysis Liuwei dihuang capsule. 　　KEYWORDS AOTF-NIR spectrometry； Liuwei dihuang capsule； Quality control； Loganin； Morroniside； Paeonol； Paeoniflorin； Ursolic acid； Content of water
　　六味地黄胶囊是中药补益剂中滋补益肾的代表方剂，处方由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、泽泻、山药、茯苓组成，为2015年版《中国药典》（一部）（后文简称“药典”）收录的成方制剂，在药典标准中含量测定项下规定，分别以薄层色谱扫描法测定其酒萸肉中熊果酸含量和高效液相色谱法测定其牡丹皮中丹皮酚的含量[1]。现有检测方法分析过程复杂，操作过程烦琐，无法满足企业生产的工业要求；并且，六味地黄胶囊处方药材种类较多，药典标准中仅测定了其中2种成分，不能全面地反映产品质量。为更全面地表征该产品质量，含量检测指标的选择需尽量覆盖处方中主要药味。
　　近红外（NIR）光谱技术具有快速、简便、无污染以及可实现多个指标同步检测等优点，作为一种“绿色”分析技术，优势突出，能够有效地应用于大批样品的快速检测，特别是对于日常的质量监控，是一种十分经济且快速的技术手段[2-6]。目前，该技术在六味地黄制剂的质量控制研究方面应用较多，如胡浩武等[7]将声光可调滤光器（AOTF）-NIR光谱技术用于浓缩六味地黄丸提取浓缩过程理化指标快速分析；史会齐等[8]采用NIR光谱技术快速测定六味地黄丸中水分含量；宋丽丽等[9]采用NIR光谱技术测定六味地黄丸中丹皮酚含量以及陈斌等[10]采用NIR光谱技术快速检测六味地黄丸中水分、丹酚皮、马钱苷含量。而本研究拟在六味地黄胶囊原质量标准基础上，新增马钱苷、莫诺苷和芍药苷等成分指标，采用AOTF-NIR光谱技术建立六味地黄胶囊中马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷、熊果酸含量及水分6个指标的NIR定量模型，旨在实现六味地黄胶囊整体质量的快速评价，为该产品质量的全面控制提供参考。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　Ultimate3000型高效液相色谱仪（美国Thermo公司）；Luminar-5030型ATOF-NIR光谱仪（美国Brimrose公司）；101A-2型电热鼓风干燥箱（上海市仪器总厂）；ME204E型电子天平、AB135-S型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SB-1200D型超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
　　1.2 药品与试剂
　　近3年内（2016-2018年）生产的六味地黄胶囊成品80批次，均由修正药业集团股份有限公司提供（规格：每粒装0.3 g，36粒/盒）；马钱苷对照品（批号：111640-201606，纯度：98.3%）、莫诺苷对照品（批号：111998-201602，纯度：96.3%）、丹皮酚对照品（批号：110708-201407，纯度：98.5%）、芍药苷对照品（批号：110736-201640，纯度：96.3%）、熊果酸对照品（批号：110742-201421，纯度：93.8%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。80批次样品信息见表1。
　　2 方法与结果
　　2.1 马钱苷、莫诺苷、芍药苷、丹皮酚的含量测定
　　查阅相关文献[11-12]，通过对供试品溶液制备方法及色谱条件优化等试验考察，最终确定最佳检测方法，实现同步测定六味地黄胶囊中马钱苷、莫诺苷、芍药苷、丹皮酚的含量。
　　2.1.1 混合对照品溶液的制備 分别取马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL中含马钱苷200 μg、莫诺苷60 μg、芍药苷20 μg、丹皮酚500 μg的混合对照品溶液，即得。
　　2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取本品内容物2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率：250 W，频率：50 kHz）30 min，放冷，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
　　2.1.3 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：ACE C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；检测器：紫外检测器；检测波长：240 nm；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，5%→10%A；15～25 min，10%→20%A；25～35 min，20%→35%A；35～55 min，35%→75%A；55～60 min，75%→5%A；60～70 min，5%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。取“2.1.1”和“2.1.2”项下溶液，在此色谱条件下进样分析，记录色谱图。结果，各成分峰与相邻峰间的分离度均大于1.5，以马钱苷峰计理论板数为298 760、以莫诺苷峰计理论板数为42 741、以丹皮酚峰计理论板数为514 094、以芍药苷峰计理论板数为191 317。色谱图见图1。
　　2.1.4 方法学考察 按相关方法操作进行方法学考察。结果，线性关系及定量限考察结果显示，马钱苷、莫诺苷、丹皮酚和芍药苷进样量线性范围分别为0.442 6～3.319 5（r=0.999 9）、0.118 2～0.886 5（r=0.999 3）、2.607 2～19.554（r=0.999 2）、0.051～0.382 5 μg（r=0.999 7），定量限分别为0.18、0.065、1.00、0.05 μg；精密度试验结果显示，马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷峰面积的RSD分别为0.95%、0.79%、0.40%、1.54%（n=6），表明仪器精密度良好；稳定性考察试验结果显示，马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷峰面积的RSD分别为0.78%、1.29%、0.30%、1.09%（n=7），表明供试品溶液在室温[（25±5） ℃]条件下24 h内稳定；重复性试验结果显示，马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷含量的RSD分别为0.80%、085%、1.13%、1.72%（n=6），表明方法重现性良好；加样回收率试验结果显示，马钱苷、莫诺苷、丹皮酚和芍药苷的平均回收率分别为104.31%、99.40%、96.50%、95.97%（n=6），RSD分别为0.91%、1.18%、1.26%、1.82%（n=6），表明该方法准确、可行。 　　2.1.5 含量测定 分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图并计算含量，测定结果见表2。
　　2.2 熊果酸含量测定
　　查阅相关文献[13-14]，通过供试品溶液制备及色谱条件优化等试验考察，确定最佳检测方法，用以测定六味地黄胶囊中熊果酸含量。
　　2.2.1 对照品溶液的制备 取熊果酸对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1 mL中含熊果酸60 μg的溶液，即得。
　　2.2.2 供试品溶液的制备 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。
　　2.2.3 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：ACE C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；检测器：紫外检测器；检测波长：215 nm；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液（89 ∶ 11，V/V），流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。取“2.2.1”和“2.2.2”项下溶液，在此色谱条件下进样测定，记录色谱图。结果，熊果酸色谱峰与相邻峰间的分离度为71.5，理论板数为14 323。色谱图见图2。
　　2.2.4 方法学考察 按照相关方法操作进行方法学考察。结果，线性关系及定量限考察结果显示，熊果酸进样量线性范围为0.119 6～1.196 μg（r=0.999 8），定量限为0.10 μg；精密度试验结果显示，熊果酸峰面积的RSD=1.26%（n=6），表明仪器精密度良好；稳定性试验结果显示，熊果酸峰面积的RSD=0.85%（n=7），表明供试品溶液中熊果酸在室温[（25±5） ℃]条件下24 h内稳定；重复性试验结果显示，熊果酸含量的RSD=1.24%（n=6），表明方法重现性良好；加样回收率考察试验结果显示，熊果酸的平均回收率为99.77%，RSD=1.28%（n=6），表明该方法准确、可行。
　　2.2.5 含量测定 分别精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液与“2.2.2”项下供试品溶液各10 μL，注入色谱仪，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图并计算含量，结果详见表2。
　　2.3 水分含量测定
　　取供试品内容物适量，按2015年版《中国药典》（四部）通则0832水分测定法中第二法烘干法[15]进行六味地黄胶囊水分含量测定，结果详见表2。
　　2.4 NIR原始光谱采集与预处理
　　取六味地黄胶囊内容物，置于样品采集槽中，扫描波长为1 100～2 300 nm，波长增量为2.0 nm，波长平均次数为300，每批次样品扫描3次，取平均值作为该样品的原始吸收光谱图，六味地黄胶囊的NIR原始吸收光谱图见图3。
　　在建立模型前，需要消除噪音和基线漂移等因素对光谱采集的影响。故先采用一阶导数9点平滑法（Savitzky-Golay）[16-17]对NIR原始光谱进行预处理，以消除颜色差别等因素引起的光谱基线偏移和漂移，六味地黄胶囊NIR预处理光谱图见4。
　　2.5 NIR定量模型的建立
　　2.5.1 校正集与验证集样本的选取 按照马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷、熊果酸、水分指标含量高低，均匀选取70批样本组成校正集样品，用于建立NIR定量模型；其余10批样本为验证集样品，用于对模型进行外部验证。校正集与验证集样本含量分布范围见表3。
　　2.5.2 各指标定量模型的建立 利用Unscrambler定量分析软件，将六味地黄胶囊上述6个指标测定结果与预处理后的NIR光谱相结合，分别以偏最小二乘法（PLS）和交叉-验证法（Cross-validation）建立各指标的定量模型[3]。采用光譜影响值Leverage和化学值误差Residual等统计量检验，剔除NIR光谱与各指标测定结果的异常值，并根据模型主要参数：内、外部验证相关系数（R2）、校正标准偏差（RMSEC）、预测标准偏差（RMSEP）等进行筛选优化，确定各指标NIR检测定量模型。其中，R2越接近1，NIR模型预测值与实测值相关性越好；RMSEC与RMSEP越接近，且RMSEC小于RMSEP，表示所建模型适用性越强，预测效果越好。6个指标的NIR定量模型模型图见图5（图中横坐标为实测值，纵坐标为预测值），参数统计结果见表4。
　　上述结果表明，参与建模的六味地黄胶囊样品中6个指标含量与其NIR光谱的相关性较好，所建立的NIR检测模型预测性能良好。
　　2.6 NIR定量模型的验证
　　利用各指标的NIR定量模型，对未参与建模的10批次验证集样品进行分析。参考“2.5.2”NIR光谱采集与处理方法获取10批样品的光谱数据，将光谱数据导入The Unscramber分析软件，调用已建立的NIR定量模型对外部样品进行分析，即得预测值。计算预测值与实测值的偏差[偏差（%）=（实测值-预测值）/实测值×100%]，验证所建定量模型的准确性。各指标的验证结果见表5。
　　由以上结果可知，10批次验证集样品中马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷的预测值与HPLC实测值的平均偏差分别为6.04%、6.05%、5.87%、6.97%、5.62%，均小于10%；水分的预测值与实测值分别平均偏差为4.83%，小于5%。由此可见，各指标NIR检测模型预测值与常规检测方法测定值之间相关性良好，测定准确性较高，可以采用NIR光谱模型快速检测、分析六味地黄胶囊成品制剂中的马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷、熊果酸、水分的含量。
　　3 讨论
　　本研究前期提升了熊果酸含量检测的薄层色谱扫描法为高效液相色谱法，同时建立了马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷同步含量测定方法，其中马钱苷、莫诺苷归属于酒萸肉，并且酒萸肉标准中以这两个指标为含量测定项；芍药苷、丹皮酚归属于牡丹皮，牡丹皮标准中以酚类成分丹皮酚为含量测定项，据文献报道牡丹皮中单萜类化物具有滋肝阴补脾阴（保肝、增强免疫力）的功效[18]。酒萸肉与牡丹皮在六味地黄胶囊处方中为主要药味，用量较大、有效成分含量高，故选定检测指标分别为马钱苷、莫诺苷、丹皮酚和芍药苷。以上建立的含量检测方法简便、准确、重复性好，可用于测定六味地黄胶囊中6个指标成分的含量，获取含量数据。接着，笔者采用AOTF-NIR光谱技术分别建立了六味地黄胶囊中马钱苷、莫诺苷、丹皮酚、芍药苷、熊果酸、水分指标的NIR光谱定量模型，实现了6个指标同步快速检测，整体表征产品质量，且建立的定量模型预测准确性较高、分析速度快，该方法的建立完善了六味地黄胶囊质量快速检测体系，为药品生产企业产品质量控制提供了可靠、便捷的检测方法。 　　参考文献
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　　（收稿日期：2018-11-23 修回日期：2019-02-28）
　　（编辑：林 静）
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