鸭坦布苏病毒的研究进展

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　　摘  要：鸭坦布苏病毒病是由坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）引起的一种以产蛋鸭产蛋量下降和雏鸭或育成鸭出现神经症状为主要特征的传染性疾病。2010年在我国江浙地区首先暴发，随后迅速波全国主要养鸭省份，给我国的养鸭业造成了极大的经济损失。本文主要从生物学特征、传播途径、流行病学、临床症状、诊断等方面阐述该病毒的最新研究进展，为其相关研究提供参考。
　　关键词：鸭坦布苏病毒;暴发;研究进展
　　中图分类号：S858.325.3     文献标识码：A     文章编号：1673-1085（2019）04-0055-05
　　自2010年4月以来，在我国主要养鸭地区，爆发了一种新型急性传染病，该病传播迅速，可造成产蛋鸭产蛋量严重下降，肉鸭或育成鸭出现神经症状等。由于产蛋鸭感染后，其特征性病变主要表现为卵泡膜出血，该疾病最初被命名为鸭出血性卵巢炎（DHO）。进一步研究证明，该病是由一种新型黄病毒——坦布苏病毒（TMUV）引起的[1]。
　　1  生物学特征
　　1.1  分类学地位  2012年，国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）公布的分类结果表明，坦布苏病毒归属于黄病毒科（Flaviviridae）、黄病毒属（genus Flavivirus），是蚊媒病毒类成员。黄病毒属有病毒70余种，包含登革热病毒（Dengue virus，DENV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、黄热病毒（Yellow fever virus，YFV）、西尼罗河病毒（West Nile virus，WNV）等多种常见病毒[2]。
　　1.2  形态结构  坦布苏病毒粒子的大小直径为40～50nm[3]，大小为10.9kb[4]。电镜下呈小球形，为对称的十二面体，表面有镶嵌糖蛋白的脂质包膜，病毒包膜内含有核衣壳蛋白，病毒核酸为单股正链RNA[5]。
　　1.3  理化特性和培养特性  坦布苏病毒为有囊膜的单股RNA病毒，可被氯仿灭活，对去氧胆酸钠敏感。在pH为1.0～5.0时不稳定。该病毒不耐热，56℃ 15min即可灭活，37℃放置48h病毒滴度由105.75 TCID50/0.2ml下降到102.25 TCID50/0.2ml，4℃放置48h后其TCID50略有下降。1.0mol/L MgCl2不能提高病毒在50℃的稳定性[6]。此外，黄病毒大多能够凝集鹅、鸽和新生雏鸡的红细胞，但其血凝素易于破坏，而且血凝反应要求比较严格的pH域[7]。
　　鸭坦布苏病毒易在9～11日龄的鸭胚、鸡胚尿囊腔或尿囊膜上生长，可以用鸭胚或SPF鸡胚来进行病毒的分离和增殖，胚的病变主要表现为：胚体出血、死亡，尿囊膜增厚，尿囊液减少[8]。鸭坦布苏病毒可以在鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸭胚成纤维细胞（DEF）上增殖，适应DEF后的病毒通常在36～48h产生CPE，随时间延长，CPE更加明显，表现为细胞折光性增强，细胞变圆以及细胞融合，最终崩解死亡[6]。
　　2  流行病学
　　本病最初于2010年春季在我国江苏、浙江等地流行，随后迅速扩散到我国主要的鸭养殖地区。我国华东（江苏、浙江、上海、福建、安徽、山東、江西）、华中（河南、湖南、湖北）、华北（北京、河北）、华南（广东、广西）等省区鸭群均有TMUV感染的报道[9]。
　　大多数黄病毒属的病毒能引起人兽共患疾病，并呈现不同的临床症状，主要引起病毒性脑炎甚至全身性感染。节肢动物是黄病毒属病毒主要的宿主和传播媒介，在自然条件下，节肢动物的分布特点受地理环境与季节气候的影响，故该类病毒的致病性也具有明显的地域性和季节性[10]。鸭坦布苏病毒不仅能在不同品种鸭鹅中传播流行，还可感染其它动物，如猪、鸡、麻雀等[11-12]。坦布苏病毒可通过库蚊传播，鸟类特别是家禽为其贮存宿主[13]。但鸭坦布苏病毒的具体传播媒介不明。该病在秋季流行严重，推测可能与蚊虫有关，但进入蚊虫较少的冬季后，该病仍然在部分地区蔓延，因此，是否有其他的传播途径有待进一步证实[14]。
　　3  临床症状及病理变化
　　产蛋鸭群多以产蛋下降为主，产蛋率从产蛋高峰（80%～90%）下降至10%以下，甚至绝产，蛋壳质量变化不明显，死淘率约1%，后期有继发性细菌感染。少量鸭站立不稳，头颈抽搐、行走不稳、共济失调，病鸭双腿瘫痪，伴有呼吸系统疾病，侧卧，发病鸭多排黄绿色粪便[15]。发病鸭各脏器均有不同程度病变，可见皮下、肌肉弥散性出血;心脏肿大、出血，心肌坏死;肝脏表面有点状坏死灶，似水煮过，有块状出血片，并且呈土黄色;脾脏肿胀、出血、淤血，甚至破裂，呈斑驳样大理石纹;肺脏肿大、肾脏肿大有坏死点，偶见出血点;卵泡变性、卵泡膜出血。雏鸭脑部均出现不同程度水肿或呈树枝状充血[16]。
　　鸭感染坦布苏病毒后的病理组织学变化主要表现为：肝实质严重变性、坏死;肺淤血，内有大量炎性细胞渗出;胰腺组织可见凝固性坏死灶;脾淋巴细胞局部减少;肾小管上皮细胞肿胀[17];脑部神经元细胞变性坏死，大量炎性细胞浸润并有“卫星现象”，脑部血管壁增厚，血管扩张充血，大、小脑神经胶质细胞增生，局部发生软化及坏死;肝脏有严重的脂肪变性，充满胆色素，毛细血管扩张[18]。
　　4  诊断方法
　　4.1  临床诊断  首先，根据鸭坦布苏病毒病的临床症状特点，产蛋鸭产蛋量骤降，死淘率大约1%;排黄绿色粪便，并且出现少量鸭站立不稳、头颈抽搐、行走不稳、共济失调症状，严重者病鸭双腿瘫痪[15]。 　　其次，根据其病理变化的特点，各脏器均有不同程度病变，表现为心脏肿大、出血，心肌坏死;肝脏表面有点状坏死灶，似水煮过，有块状出血片，并且呈土黄色;脾脏肿胀、出血、淤血，甚至破裂，呈斑驳样大理石纹;肺脏肿大，肾脏肿大、有坏死点，偶见出血点;卵泡变性、卵泡膜出血;脑部出现不同程度水肿或呈树枝状充血[15-16]。
　　根据以上的临床症状和剖检病理变化来初步怀疑是否是鸭坦布苏病毒病，然后再进行实验室诊断方法来确诊。
　　4.2  血清学诊断
　　4.2.1  酶联免疫吸附试验  酶联免疫吸附试验（ELISA）方法是在实验室血清学中最常用的检测方法之一，具有特异性强、灵敏度高及检测速度快等特点，目前广泛应用于动物的疾病诊断和疫苗效果的评价。
　　姬希文等[19]、张德宝[20]和陈伟国等[21]等研究利用纯化的鸭坦布苏病毒奉贤株（FX2010）作为包被抗原，建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法，并且对各种检测条件进行了优化。该方法具有较高的敏感性和特异性。施少华等研究了以纯化的鸭坦布苏病毒WR株为包被抗原，建立检测鸭坦布苏病毒卵黄抗体的间接ELISA方法[22]。万春和等对鸭坦布苏病毒非结构蛋白NS1基因进行原核表达，并进行生物学活性鉴定，并将表达成功具有生物学活性的重组蛋白经纯化后，作为抗原包被ELISA平板，通过条件优化，建立检测禽坦布苏病毒血清学检测方法[23]。李晨曦等利用DTMUV特异性抗原表位建立Epitopc-ELISA血清学诊断方法，并对126份鸭血清样品进行检测，以中和试验作为标准进行比较，结果显示Epitopc-ELISA检测方法的相对特异性为100%，相对敏感度为96%，并且Epitopc-ELISA与其他黄病毒血清间不出现交叉反应性[24]。
　　4.2.2  乳胶凝集试验  乳胶凝集试验（LAT）具有准确灵敏、简便易行、特异性强等优点，被广泛应用于畜禽传染病的血清学检测。用于鸭坦布苏病毒抗体的临床检测，不需要特殊设备，且可在1～5min内肉眼观察判定结果，临床应用简便快速[25]。
　　万春和等以经超速和密度梯度离心浓缩纯化的鸭坦布苏病毒抗原进行方阵滴定，筛选出致敏乳胶的最佳条件，并制备成鸭坦布苏病毒乳胶凝集试验（LAT）用抗原，与特异性的鸭坦布苏病毒阳性血清反应出现肉眼可见的凝集颗粒，进而建立检测鸭坦布苏病毒抗体的乳胶凝集试验方法[25]。陈浩等用其实验室制备并纯化的抗坦布苏病毒 PrM 蛋白单克隆抗体致敏乳胶，采用方阵法，优化乳胶凝集试验的最佳条件，建立坦布苏病毒反向乳胶凝集试验并应用于临床样品的检测[26]。
　　4.3  分子生物学检测技术
　　4.3.1  RT-PCR检测技术  张帅等在对 DTMUV序列的比对分析的基础上，设计了1对特异性引物，通过优化PCR反应条件，建立了 DTMUV的一步法RT-PCR检测方法。该方法具有特异、快速、敏感、准确等特点，可以检出1.82个TCID50的病毒核酸[27]。傅光华等、祖立闯等和王永娟等根据连接酶依赖PCR工作原理设计并建立一种坦布苏病毒RT-PCR快速检测方法[28～30]。
　　4.3.2  实时荧光定量RT-PCR检测技术  李庆阳等根据鸭坦布苏病毒BYD-1株基因序列设计特异性引物和TaqMan探针，建立了快速检测 DTMUV的实时荧光定量RT-PCR方法[31]。万春和等根据鸭坦布苏病毒NS5基因序列设计引物，建立基于SYBGreenⅠ检测模式的实时荧光定量 RT-PCR，该方法在2.74×103～2.74×107拷贝/μl反应范围内有很好的线性关系[32]。刘青涛等根据鸭坦布苏病毒NS2A基因的保守序列，设计并合成了1对特异性引物，建立了一步法实时定量RT-PCR检测方法[33]。
　　张艳芳等针对GenBank中DTMUV基因和鸭瘟病毒（DPV）UL6基因的保守序列，设计合成了2对引物和2条TaqMan探针。通过优化反应体系和条件，建立了鉴别DTMUV和DPV的二重荧光定量RT-PCR方法[34]。孙敏华等参考GenBank上已发表的产蛋下降综合征病毒（EDSV）五邻体基因序列、H9亚型禽流感病毒的HA基因和鸭坦布苏病毒E基因序列，分别设计了检测EDSV、H9 AIV和DTMUV的特异性引物，扩增目的片段大小分别为110bp、281bp和266bp，通过PCR验证及引物浓度的优化，建立了针对这3种病毒的三重荧光 PCR检测方法。该方法可以同时检测EDSV、H9AIV和DTMUV，且不能检出1型鸭甲肝病毒、3型鸭甲肝病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、新城疫病毒和大肠杆菌基因组 DNA，敏感性试验表明，该方法对EDSV、H9 AIV和DTMUV核酸的检测下限分别为8.0、4.8和1.3个拷贝，比常规PCR方法敏感10倍[35]。
　　4.3.3  反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测技术  LAMP技术通过两对引物，利用Bst DNA聚合酶的链置换活性提供反应的动力，在恒温条件下完成对核酸的扩增反应[36]。该技术于恒温条件下几十分钟内即可完成，无需昂贵的仪器设备，结果可肉眼直接观察，具有简便、快速、灵敏度高、特异性好等特点[37]。韩凯凯、董嘉文和吴植等根据GenBank中登录的鸭坦布苏病毒基因序列，分别建立了基于LAMP技术的鸭坦布苏病毒检测方法[38～40]。
　　5  结语
　　鸭坦布苏病毒病在我国流行以來，对我国养殖业带来了严重的危害，对养殖户造成了极大的经济损失。目前市场上已有商品化的弱毒疫苗，并对该病起到了很好的防控作用。当前对鸭坦布苏病毒的研究已经很多，但是在传播途径、致病机制和公共卫生等方面还需要更深一步的研究。 　　参考文献：
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　　收稿日期：2019-03-22
　　*基金项目：国家重点研发计划（2016YFD0500800）;山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队计划（SDAIT-11-01）。
　　作者简介：任斌斌，男，山东人，硕士研究生，E-mail：renbinbinhappy@163.com。
　　**通讯作者：黄兵（1973.12-），男，贵州余庆人，研究员，研究方向为动物分子病毒学与免疫学，一直从事新城疫、禽流感、传染性支气管炎等禽重要传染性疾病快速检测技术、无特定病原鸡微生物监测技术及基因工程药物的研究，E-mail：hbind@163.com。
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