核桃内果皮木质素生物合成途径关键基因研究进展

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　　摘要：木质素（Lignin）是陆生维管植物次生细胞壁中含量丰富的高分子有机化合物，与植物细胞壁内的纤维素和半纤维素交织在一起。木质素在核桃硬壳（内果皮）中含量丰富且是其构成的主要成分，含量约在60%以上，目前生产中核桃缝合线松弛以及核桃内果皮发育不全（露仁）现象成为制约新疆核桃优质高产的主要因素，新疆要实现核桃的优质高产以及木质素的充分合理的利用，需进一步了解木质素的结构、组成及关键基因表达调控。因此，重点对木质素结构、木质素生物合成过程及基因调控规律等方面分析基因调控规律，为从植物木质素合成及表达量方面改善新疆核桃品质奠定理论基础。关键词：核桃;木质素;生物合成途径;调控基因
　　核桃（Juglans regia L）在中国资源丰富且栽培历史悠久，因其富含蛋白质、脂肪、碳水化合物等人体所必需物质及铁、锌、锰等多种微量元素，对于延缓人体衰老、心血管的保健作用、预防慢性疾病等具有非凡意义，有着极佳的保健效果和药用价值，在国内、国际市场均具有巨大的消费潜力。新疆得天独厚的自然生态条件使其是我国核桃重要产区之一，伴随着核桃种植面积及品质的综合发展，培育出仁率高、易机械脱皮适于深加工的核桃品种是当前核桃育种及品种改良的主要目标之一。其中新疆珍稀核桃种质‘温138’平均出仁率高达83.2%，产量极高、果壳极薄、极易脱皮，但壳面（内果皮发育不完整或部分退化）开裂导致露仁，是珍贵的遗传育种资源。
　　研究表明，核桃内果皮的主要组分是木质素（Lignin），木质素是陆生维管植物适应环境的进化特征之一，同时也是构成其细胞壁的主要成分之一，主要存在于植物木质化程度高的硬组织中与纤维素、半纤维素等多糖分子通过氢键、共价键等作用相互交联在一起，通常起到增强细胞壁的沉积、提高细胞壁机械强度及硬度的作用，具有较强的不渗水性，对病原体具有保护的作用，其稳定性较高从而使得植物细胞壁具有抗氧化、阻燃、机械支持及生物防御等功能。木质素的物理及化学性质也使得植物体具有防止虫害和病原体侵入的作用。植物体木质素生物合成途径及调控是一个复杂的过程，目前关于木质素单体合成途径已基本清晰，但木质素聚合机理仍未系统阐述清楚。本文从木质素结构、木质素生物合成过程及基因调控规律等方面分析基因调控规律，以期从分子育种途径调节核桃内果皮木质素生物合成途径中关键基因，为进一步改良核桃果实品质提供理论依据。
　　1核桃内果皮研究
　　核桃由内果皮（硬壳）和种仁组成，内果皮作为核桃重要组成部分，具有比表面积和孔隙率大、机械强度高、可再生和降解等优点，在核桃果实发育、加工及贮藏中均起着重要作用。目前对核桃内果皮结构（缝合线紧密度、厚度、机械强度）与种仁商品品质的关系研究较多，及内果皮做吸附剂吸附重金属获染料的研究較多。
　　研究表明，核桃内果皮最主要组分为木质素（GS型木质素，其中G型木质素高达80.68%），内果皮越厚核桃缝合线越紧密，且硬壳厚度与坚果质量存在极显著的正相关关系，与出仁率存在极显著的负相关关系。近年来通过研究核桃内果皮（包括核桃壳粉）对Cu2+、As3+、Cr6+、pb2+等金属离子分别进行直接吸附、活性吸附剂等吸附试验，发现通过物理化学方法活化后吸附量比直接做吸附剂的效果好，其吸附性均对金属离子均具有选择吸附性。
　　2木质素结构
　　木质素是具复杂三维网状芳环结构的酚类高分子聚合物，是一种珍贵难降解的天然可再生资源且含量高。其相对含量达生物质的1/3左右且能量最高。通过氢键、酯键、醚键、范德华力等共价键与非共价键的共同作用，与纤维素、半纤维素连接并交织在形成复合体，在植物中起到抵抗压力、硬化细胞壁、增强植物体的机械强度的作用，但很难造成分离纯化木质素。
　　木质素是植物体内含有大量醇羟基、酚羟基、羰基等活性基团的复杂天然大分子，其含碳60%、氧30%、氢6%及氮0.67%左右，同时具备糖及酚的特点，因此反应类型十分丰富，能与不同物质发生不同化学反应。木质素主要由对一羟基苯基木质素（bydroxy-phenyllignin，H-木质素）、愈创木基木质素（guaiacyl lignin，G-木质素）和紫丁香基木质素（syringyl lignin，S-木质素）3种木质素单体亚单位构成，分别来自香豆醇（p-coumaryl alcohol）、松柏醇（coniferyl alcohol）和芥子醇（sinapyl-alcohol）3种苯丙烷。其中香豆醇结构中没有甲氧基基团，芥子醇比松柏醇多了一个甲氧基基团且芥子醇无游离的C-5，导致不能与其它单体形成较稳定的C-C连接，因此S-木质素结构疏松在木质素分离时较G和H型木质素易被去除。通常20多种化学键连接在一起构成木质素单体，随着木质素相关研究的深入，发现植物体木质素的构成不仅由这3种木质醇组成，还有木质醇的不完全生物合成过程中生成的5-羟基松柏醇、羟基肉桂醛、羟基肉桂酸等单体也参与了木质素的聚合过程，且在植物中发现锰过氧化物酶（MnP）、漆酶（L）、漆酶/木聚糖酶体系（LXS）、漆酶/介体体系（LMS）等可直接降解木质素。
　　3木质素生物合成途径
　　木质素生物合成途径通常由羟基化、连接反应、甲基化、氧化还原反应、聚合反应等复杂过程交互完成，由于植物自身发育、外界环境的影响，加之一些未知酶或基因对木质素生物合成造成影响或修正原有功能及作用，目前木质素基本合成过程中木质素单体的合成、贮藏、运输及木质素单体脱氢羟化聚合为木质素的过程还不是完全清楚。经过木质素方面多年的研究基础，发现木质素单体生物合成途径首先是二氧化碳在植物光合作用下产生的葡萄糖经酶促反映生成苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸的莽草酸途径，这是植物体、细菌及真菌特有的代谢途径;其次是苯丙氨酸经过脱氨基、甲基化、羟基活化等过程到反式-4-羟基肉桂酸（HCA）及其辅酶A脂类化合物的苯丙烷代谢途径;最后是对羟基肉桂酸（HCA）及其辅酶A脂类化合物氧化还原为木质素单体，再进一步强化脱氢聚合生成木质素的木质素合成特异途径。 　　木质素生物合成途径主要包括苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，简称PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（Cinnamic acid 4-hydroxylase，简称C4H）、肉桂酸-3-羟基化酶（Coumaric acid 3-hydroxylase，简称C3H）、咖啡酸-O-甲基转移酶（Caffeic acid O-methyl-transferase，简称COMT）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate CoA ligase，简称4CL）、阿魏酸-5-羟基化酶（Ferulic acid 5-hydroxylase，F5H）、莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶（Shikimate/Quinate hydroxycin-namo订transEerase，简称HCT）、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（Caffeoyl-CoA O-methyltransferase，简称CCoAOMT）、对羟基苯乙烯酰辅酶A-3-脱氢酶（Coumaroyl-CoA3-Hydroxylase，简称CCoA3H）、肉桂酰辅酶A还原酶（CinnamoyI-CoA reductase，简称CCR）、肉桂醇脱氢酶（Cinnam订alcohol dehydrogenase，简称CAD）等参与。目前苯丙烷代谢途径和木质素合成途径占据木质素生物合成过程重要地位但其相关研究还不够深入彻底，也因此这两种途径成为国内外专家学者在木质素方面的研究热点。
　　4木质素合成途径中关键调控基因
　　木质素生物合成途径及其调控过程复杂，根据其途径中关键酶调控效果可分为3类：（1）苯丙烷代谢途径调控基因，主要由PAL（苯丙烷类代谢途径首个限速酶）、C4H（细胞中起结构支架作用的单氧化酶）及4CL（连接木质素前体及各个分支反应的关键酶）参与调控;（2）木质素特异合成途径上游基因调控，主要由Call（控制木质素代谢过程H-单体向G/S-单体转化的关键酶）、COMT（参与C5位置甲基化的重要甲基化酶）、CCoAOMT（参与芳香环上羟基的甲基化酶）、FsH（CYP84家族决定S一木质素前体的限速酶）参与调控;（3）木质素单体特异合成途径下游基因调控，下游调控基因由CCR（控制木质素合成及微纤夹角）和CAD（木质素生物合成中最后一步关键催化反应酶）组成。
　　4.1苯丙烷代谢途径调控基因
　　PAL存在于多数绿色植物和少数细胞细菌、真菌和藻类中，在植物体内苯丙烷代谢途径中催化苯丙氨酸脱氨生成氨和反式肉桂酸，对细胞分化、木质化过程、抗旱、抗寒、抗病虫害等方面均起到重要作用。Korth等在转基因烟草中上调PAL基因，木质素含量及PAL的活性均增加;邹丽红等在砂梨研究中抑制PAL活性降低了木质素含量及石细胞含量，但并未改良砂梨果品品质。C4H是细胞色素P450家族CYP亚家族中的一种单氧化酶，在细胞中起着结构支架的作用，Sewalt等对转基因烟草研究中发现抑制C4H表达会导致植物体内S/G值下降，木质素含量出现降低同时其构成改变，但植株生长正常未出现异常;Blee K等在烟草研究发现中发现抑制植株中C4H活性，S/G比值出现显著降低且木质素的含量明显下降，植物生长正常未出现异常。通过对4CL序列分析发现4CL基因主要从玉米、水稻等单子叶植物和拟南芥、烟草等双子叶植物中被克隆出来，随后研究发现4CL在植物体内主要以基因家族的形式存在，位于苯丙烷类及其衍生物生物合成的关键点上。倪志勇等在拟南芥、烟草、白杨、毛白杨等植物的研究中发现，抑制4CL基因表達会引起植物体内木质素含量显著降低，其中S/G比值却会根据植物种类的不同而有所差异，在拟南芥植株中G-木质素的含量显著降低，在烟草植株中S-木质素的含量显著降低，而在白杨中植株S/G却没有明显变化。综上所述，下调这4种酶活性或抑制基因表达，植株体内木质素含量显著降低。
　　4.2木质素特异合成途径上游基因调控
　　C3H是细胞色素P450 CYP98A3基因家族之一，在植物木质素代谢过程中主要调控H单体向G、S单体转化。Reddy等对苜蓿反义抑制研究中发现降低C3H活性木质素含量没有明显变化，但H单体相较G、S单体其含量显著增加;Coleman等研究发现降低C3H基因表达，S/G比值也显著增加（木质素总含量显著下降）;Ralph J等降低白杨中C3H基因表达，木质素总量降低为原来的一半，其中G-木质素和S-木质素含量均下降，但是原本含量较低的H-木质素则显著增加的现象。COMT植物体内主要起到合成和调控S-型木质素的作用。通过研究发现，抑制玉米、银合欢、紫花苜蓿等植物中COMT活性，木质素含量均出现明显下降现象。Lapierre等研究转基因白杨、高羊茅等植物发现，调控COMT一般只影响S/G比值，木质素含量变化不明显，只有在高水平抑制表达时才能起到降低木质素总含量的作用。CCoAOMT比COMT发现的晚些，主要参与S/G-型木质素的合成及调控作用。最早对拟南芥、苜蓿等植物研究发现，抑制CCoAOMT的表达木质素含量明显降低同时其组分发生改变;在抑制甜荞、桉树等植物中CCoAOMT基因的表达，能显著降低木质素含量，其中甜荞中CCoAOMT基因表达量与木质素含量呈显著正相关;在亚麻、杨树等植物中抑制CCoAOMT基因的表达，木质素含量不仅降低同时伴有植株生长畸形、木质部结构发生变化等现象。其中反义共转化COMT、CCoAOMT基因表达，使转基因烟草植株木质素含量下降幅度更大，说明存在协同效应及交叉作用。F5H在植物体中起限制S一型木质素合成的作用，通过调控F5H基因的表达虽然不能起到降低木质素总含量的作用，但过量表达F5H基因导致S-型木质素单体含量增加（S/G比值增大），使的木质素更易于从植物体内去除。调控上述3种酶活性不仅起到降低植物木质素含量的作用且起到改变木质素组分的作用。
　　4.3木质素单体特异合成途径下游基因调控
　　CCR催化3种羟基肉桂酸辅酶A酯生成相应肉桂醛，紧接着CAD通过NADPH将3种肉桂醛通过氧化还原反应催化生成3种对应的肉桂醇，对其展开的相关研究相对较早。Relph等（1998）研究发现，抑制CCR的表达使植物体内木质素总含量显著下降，且组分会发生相应改变。研究发现降低转基因杨树（Populus tremula×Populus alba）、玉米、黑麦草中CCR的活性，植株中木质素总体含量将会降低甚至到原来含量的一半，植株的表型出现异常且生长活力不足。研究发现在拟南芥、杨树、甜荞等植物中降低CAD基因的表达量往往伴随着木质素含量降低或影响木质素单体的组成，植株表现型通常正常。
　　5木质素研究问题与展望
　　通过近年来的不断探索目前已研究开发出上百种的木质素产品，但是由于木质素结构复杂多变、化学成分尚不完全清楚、化学性质极不稳定等因素制约，我们对木质素的空间结构和代谢途径了解还不透彻，目前只有少数植物中的木质素建立了结构模型，可能还有很多与木质素相关的基因没有被发现，关于核桃露仁现象及与之相关核桃内果皮硬化过程中木质素沉积的系统分子机理尚不清楚，如何深挖露仁核桃资源在生产加工、遗传育种上的应用潜能，加强新疆特有露仁核桃种质资源的保存与保护，深层次发挥露仁优良基因在新疆高品质露仁核桃育种中的实践价值，是当前核桃育种基础研究和生产实践中亟需解决的问题。通过克隆得到木质素生物合成途径中关键基因并加以调控，从而起到改变植物体木质素含量及其组分的相关研究也成为近几年研究的热点。在基因调控方面，人们在不同植物克隆并获得木质素含量改变植株，目前核桃（Juglans regia）全基因组测序已完成，深入研究核桃内果皮木质素代谢途径相关基因的功能、核桃硬核期基因调控方面提供理论基础，可以为今后开展核桃遗传图谱构建、分子标记辅助选择和品质改良、重要性状基因的克隆与功能验证等分子育种工作打好基础。
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