DNA甲基化在基因表达调控中的意义及研究进展

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　　[摘要] DNA甲基化修饰作用是目前表观遗传学的研究热点。其参与基因表达调控、基因沉默、DNA损伤修复以及癌症发生等重要生物学过程，大多癌症的致病过程、免疫系统疾病、阿尔茨海默病等疾病都涉及表观遗传学改变，基因的甲基化主要发生在富含GC碱基序列的CpG区域，基因在相应的甲基化转移酶的作用下调控癌基因、致癌基因的表达和DNA的损伤修复等。本文结合最新研究进展综述DNA甲基化在基因组中的基因表达调控中的意义及研究进展。
　　[关键词] 启动子;甲基化;基因表达调控
　　[中图分类号] R34          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）05（b）-0033-04
　　[Abstract] DNA methylation modification is a hot research topic in epigenetics. Its involved in regulating gene expression， gene silencing， DNA damage repair， and cancer， and other important biological processes， most of the pathogenic process of cancer， immune system diseases， Alzheimer′s disease are involved in epigenetic changes， gene methylation is mainly in the areas rich in GC base sequence of the CpG， gene under the action of the corresponding methylation transferase regulate the expression of cancer gene， oncogene and DNA damage repair， etc. In this paper， the significance and research progress of DNA methylation in gene expression regulation in genome were reviewed.
　　[Key words] Promotor; Methylation; Gene expression regulation
　　表观遗传学指基因的核酸序列不发生改变的情况下基因的表达却发生了可遗传改变的现象，甲基化是一种重要的表观遗传修饰作用，它可在不改变基因序列的前提下，对基因序列中的碱基进行甲基基团修饰，以此抑制或促进基因的表达而影响机体功能，是生物体内蛋白质和核酸的一种重要的修饰方式，与癌症、衰老、免疫系统等多种疾病的发生发展密切关联，是表观遗传学的热点研究内容[1-2]。如结直肠癌细胞中有许多异常的甲基化基因，主要包括非启动子区域的总体低甲基化和启动子区域的高甲基化[3]，基因低水平甲基化或去甲基化可激活基因的表达，导致癌基因表达上调或细胞染色体空间结构不稳定;基因高水平甲基化则关闭或沉默某些基因的活性，使得抑癌基因表达下调或DNA损伤修复受抑制，进而影响细胞周期、细胞凋亡等功能。
　　1 DNA甲基化与基因表达
　　DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的作用下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程，可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等，哺乳动物的DNA甲基化主要发生在G/C含量丰富的5′-CpG-3′序列的C碱基上。人类的CpG以两种形式存在，一种是分散于DNA序列中，另一种是CpG结构高度聚集的CpG岛，在正常组织里，70%～90%散在的CpG是被甲基修饰的。
　　DNA甲基化通过甲基化碱基序列而影响核酸空间构象、稳定性及其与蛋白质相互作用方式等，起到调控基因表达的作用。一般情况下，基因启动子CpG岛甲基化与基因表达呈负相关，基因内部的甲基化与基因表达也存在着弱的负相关。哺乳动物细胞内主要包含5种类型的DNA甲基化酶（DNA methyl transferase，DNMT），分别是DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，但只有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B三种酶具有甲基转移活性，分为持续性甲基转移酶和从头甲基转移酶，前者主要是DNMT1，它能使DNA双链其中的一条链完全甲基化，参与DNA复制过程中新合成链的甲基化;后者主要包括DNMT3A和DNMT3B，在早期哺乳动物胚胎中高表达，但在细胞分化过程中表达降低，主要甲基化人类基因中CpG序列，使其半甲基化，继而全甲基化。有研究[4-6]认为从头甲基转移酶可能参与细胞生长分化调控，其中DNMT3A以自抑制的形式存在，且组蛋白H3尾部可促进及诱导其活性参与细胞的基因表达调控及细胞分化。
　　2 基因甲基化调节基因表达调控的方式及意义
　　2.1 甲基化启动基因序列，导致基因沉默
　　启动子是基因表达与否的“开关”，是基因表达过程中RNA聚合酶特异性识别并结合的部位，富含GC序列并组成很多CpG岛，启动子中的DNA甲基化通过招募参与基因阻遏的蛋白质后抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达，进而沉默或抑制基因表达，是甲基化抑制剂假定的治疗靶点。众多肿瘤的一个重要特征是对应癌基因的DNA启动子局部低甲基化，抑癌基因启动子高甲基化，异常的DNA甲基化可作为肿瘤诊断、分类和治疗的重要分子标志物[7-8]。
　　2.1.1 甲基化启动子中转录因子的结合体位点  启动子中一般存在大量CpG岛，这些岛呈高度甲基化状态，甲基化可改变启动子在基因中的原始构型，进而干扰特异性转录因子与启动子上的特异识别位点结合，进而影响下游基因的转录调控，影响肿瘤的发生发展。有学者分析发现多发性骨髓相关基因DAZAP2启动子的CpG2岛上存在许多转录因子结合体位点，通过生物素5′端标记AP-2、CREB、c-Rel非甲基化（甲基化）转录因子结合位点探针，提取KM3细胞核蛋白，进行凝胶阻滞实验发现，甲基化结合位点中的胞嘧啶能够抑制某些转录因子与其结合位点的结合，DAZAP2基因的高度甲基化使得轉录因子结合大大降低，导致基因表达显著下调[9]。 　　2.1.2 启动子中的甲基化序列与其特异性蛋白结合  启动子中的甲基化序列通过与细胞核内的甲基化CG序列结合蛋白特异性结合，间接导致转录因子不能与基因结合形成转录复合物，导致基因沉默或基因表达转录终止，去甲基化则导致基因表达上调。白细胞介素-10（IL-10）与宫颈肿瘤的癌变呈正相关，肿瘤相关巨噬细胞是IL-10的重要来源细胞之一，而转录因子特异性蛋白（Sp1）可结合IL-10基因启动子上富含GC序列的顺式作用元件，张琪[10]研究发现肿瘤相关巨噬细胞中IL-10基因启动子区域去甲基化促使转录因子Sp1与其结合而促进IL-10的表达。
　　2.2 甲基化导致基因点突变
　　DNA甲基化引起基因突变的机制主要是DNA序列在甲基化酶的作用下促进C（胞嘧啶）和5mC脱氨，抑制U的修复，并且使碱基U→T改变，进而导致CpG序列的C→T突变。有研究[10-11]报道发现非小细胞肺癌老年患者支气管肺泡灌洗液内P53基因突变导致患者视黄酸受体（RAR）-β基因的启动子区域甲基化率提高，进而导致该基因表达沉默，促进肿瘤细胞的生长和增殖，而正常人中的RAR-β基因的甲基化水平较低。临床研究认为大多单独发生的泛发性脓疱型银屑病（generalized pustular psoriasis，GPP）是由IL36RN基因的纯和或复合突变引起的，北京协和医院的学者[12]通过研究发现GPP患者单核细胞全基因组DNA呈现异常甲基化状态，与正常个体比较，其甲基化程度升高的位点5921个，甲基化程度降低的位点407个，GPP患者外周血单核细胞中的PDCD1基因呈高度甲基化状态，DCD1的mRNA表达水平显著降低，且与甲基化水平呈负相关，进一步表明DNA甲基化导致的核苷酸序列改变可能是参与GPP发病的重要机制之一。
　　2.3 甲基化影响基因错配修复
　　基因突变和基因启动子区的高水平甲基化是导致在错配修复基因表达缺陷的两大主要原因。组蛋白的翻译后修饰在DNA损伤信号应答和修复中发挥了重要功能，其修饰的异常往往会导致DNA修复应答通路的阻断和异常，最终导致细胞凋亡或基因的不稳定性[13]。甲基化是组蛋白最常见的翻译后修饰，H3K36甲基化（组蛋白H3第36位赖氨酸甲基化）在DNA双链断裂修复和错配修复等损伤修复活动中也发挥重要调控作用，对于赖氨酸残基的甲基化修饰包括单甲基化、二甲基化或三甲基化修饰。Li等[15]通过研究发现，H3K36me3直接与hMSH6的PWWP结构域结合，保证了体内招募错配识别蛋白HMUTsα与染色质的结合，在细胞周期的G1和S早期，H3K36me3的大量表达保证了hMutSα在DNA复制过程中引入错配修复前就富集在染色质上，而缺失H3K36甲基转移酶SEDD2细胞则会出现微卫星不稳定性以及自发突变频率上升的现象，提示人源细胞中H3K36me3修饰调控DNA损伤修复，且与癌症的发生紧密相关。
　　3 DNA甲基化与癌症
　　肿瘤是一种高度异质性的疾病，近十年来科学家们开始相信表观遗传学改变在癌症中发挥重要作用，特别是DNA甲基化。甲基化是基因组DNA在转录水平上进行调控的一种自然修饰方式，参与基因表达调控，进而参与细胞的生长发育、逆境胁迫应答等过程。当基因体内的启动子出现甲基基团损失而导致基因表达异常蛋白质，进而影响正常细胞的结构和功能，细胞变异并可能导致癌症。
　　癌细胞与健康细胞在DNA甲基化的异同可以用于解释基因的肿瘤特异性表达差异，还可以用于发现生物标志物帮助检测肿瘤、预测癌症，预测肿瘤患者的预后，为肿瘤患者制订治疗计划，癌细胞基因甲基化研究可用于研发一些干扰癌细胞甲基化的靶向药物来调节细胞的基因甲基化模式，从而将癌细胞调整为正确的甲基化模式，抑制肿瘤生长[16]。美国加州大学的张鹍教授就已创造高通量甲基化无创检测技术，他们团队利用癌症标志物和组织特异性CpG甲基化模式的双重信号来检测和定位癌症，可用于癌症的早期筛查与溯源[17]。有学者[18]认为DNA甲基化是癌症的起始阶段，DNA甲基化水平的检测以及这些甲基化之间的“亲密程度”能判断癌症进程所处阶段。基因甲基化是癌症发生发展的一种警示性标识，对细胞的基因进行甲基化检测、计数、绘图等有助于医生对癌症进行诊断、甄别、预防及治疗，也有助于理顺疾病的发病机制。
　　4 DNA甲基化与其他疾病
　　大量研究[19-20]均发现异常的DNA甲基化在癌症、心血管疾病、精神疾病、自身免疫系等多种疾病发生发展中具有重要角色。Shinagawa的研究团队[21]通过焦磷酸测序发现早期认知障碍及阿尔茨海默病患者的NCAPH2/LMF2基因启动子的甲基化水平上调，并认为这种甲基化可影响神经元细胞丢失进而对疾病产生影响。宁波大学的刘桂利[22]研究发现OPRK1、OPRM1基因甲基化修饰与老年痴呆症关联，并通过实验发现这两个基因在老年痴呆患者中均表现为高甲基化水平并且与疾病表型密切关联。
　　细胞因子是一种由巨噬细胞、T细胞等免疫细胞产生的小分子多肽，具有细胞调节免疫应答、组织损伤修复、参与炎性反应、间接杀伤癌细胞等生物学作用，DNA甲基化水平的变化可导致细胞因子的表达异常，进而影响T细胞分化及反应性发生改变。DNA低甲基化可导致如CD70、CD28、CD11a/CD18等细胞因子的基因表达上调，激活自身反应性T细胞，进而促进B细胞分泌免疫球蛋白，引起系统性红斑狼疮的自身免疫紊乱。有学者[23]研究发现哮喘患者外周血中促进炎症发生的细胞因子如γ-干扰素、IL-1β、肿瘤坏死因子α、IL-17A基因的启动子区域的甲基化水平低于健康人群，而外周血抗炎性因子如IL-4、IL-10基因甲基化程度较正常增高，细胞因子基因上的DNA异常甲基化对细胞因子的转录及功能有重大影响，可导致免疫反应调节紊亂，影响哮喘病程的发生发展。
　　5 展望 　　甲基基团是人类基因的重要组分，DNA出错并甲基缺失是导致癌症发生的重要原因。DNA的甲基化与癌症的发生发展过程密切相关，甲基化的检测将来或可助力癌症检测、预测癌症的复发等。甲基化不仅与癌症密切相关，也与其它疾病密切相连，如人体衰老、肥胖、人体成瘾性等[24-25]，DNA甲基化的模式因疾病不同而异，应与疾病的亚型、预后及药物反应等临床信息相对应，随着对DNA甲基化研究的深入，基因甲基化检测将会成为精准医疗的重要组成部分，帮助临床医生对患者基因进行个体化诊断和治疗。
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　　（收稿日期：2018-10-29  本文编辑：封   华）
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