KIF14在前列腺癌细胞中的表达及作用

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　　摘要：目的  研究驱动蛋白家族成员14（KIF14）在前列腺癌（PCa）细胞中的表达和对PCa细胞的生物学功能的影响。方法  采用RT-PCR检测KIF14在PCa细胞系中的RNA表达情况。使用siRNA（siKIF14组或siControl组）分别敲减PCa癌细胞22Rv1，RT-PCR验证敲减效率后，采用细胞计数、Transwell试验分别检测对两侧细胞增殖、迁移的影响。结果  KIF14在多种PCa细胞系中过表达;siKIF14组22Rv1细胞的 KIF14的mRNA水平相比siControl组降低，表达量下降达（88±2）%，差异有统计学意义（P<0.05）;在KIF14表达被敲减后，siKIF14组细胞增殖相比siControl组在24 h和48 h均降低，差异有统计学意义（P<0.05）;Transwell小室试验检测结果显示，24h后，siKIF14组细胞迁移数（139.33±28.74）/每视野，较siControl组的（436.00±51.56）/每视野减少，差异有统计学意义（P<0.05）。结论  KIF14是潜在的癌基因，敲减KIF14表达可抑制PCa细胞的增殖与迁移，可能在PCa进展中发挥作用。
　　关键词：驱动蛋白家族成员14;前列腺癌;癌基因;增殖
　　中圖分类号：R737.25                                文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.09.022
　　文章编号：1006-1959（2019）09-0068-03
　　Abstract： Objective  To study the expression of kinesin family member 14 （KIF14） in prostate cancer （PCa） cells and its effect on the biological function of PCa cells. Methods  The expression of KIF14 in PCa cell line was detected by RT-PCR. PCR cancer cells 22Rv1 were knocked down by siRNA （siKIF14 group or siControl group）， and the knockdown efficiency was verified by RT-PCR. The effects of cell proliferation and migration were detected by cell counting and Transwell assay， respectively. Results  KIF14 was overexpressed in various PCa cell lines. The mRNA level of KIF14 in 22Rv1 cells of siKIF14 group was lower than that in siControl group， and the expression level decreased （88±2）%， the difference was statistically significant （P<0.05）. After KIF14 expression was knocked down， the cell proliferation of siKIF14 group was lower than that of siControl group at 24 h and 48 h，the difference was statistically significant （P<0.05）. The results of Transwell chamber test showed that after 24 h， the number of cell migration in the siKIF14 group （139.33±28.74）/per visual field was lower than that in the siControl group （436.00±51.56）/per visual field，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion  KIF14 is a potential oncogene. Knockdown of KIF14 expression can inhibit the proliferation and migration of PCa cells， which may play a role in the progression of PCa.
　　Key words：Kinesin family member 14;Prostate cancer;Oncogene;Proliferation
　　前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一，在美国其发病率居第1位，也是男性癌症死亡第2大原因[1]。近年来国内PCa发病率及死亡率逐年增高。部分PCa患者发现时已进展，失去手术机会，长期存活率不理想[2]。PCa发生、进展以及向激素非依赖转变的分子机制目前仍不明确，通过研究其机制，尝试在分子水平对其进行干预，是目前PCa研究领域的热点和难点之一，更有效的治疗策略及新靶点是该研究领域亟待解决的问题，对于PCa的防治具有重要意义。尽管在PCa中发现基因组改变方面取得了较大进展，但新的基因组生物标记和蛋白质仍有待鉴定。驱动蛋白家族蛋白（KIFs）是ATP-和微管相关的运动蛋白，参与细胞分裂，微管聚合物动力学，细胞内运输和信号转导[3]。驱动蛋白家族成员14（KIF14）含有C末端激酶结合区和调节胞质分裂结合区的N末端蛋白[4，5]，在双极纺锤体形成过程中与染色质和微管结合[4-6]。KIF14表达上调可诱导快速且容易出错的有丝分裂，导致肿瘤发生过程中的非整倍体形成[6]。虽然KIF14的确切分子功能仍在研究中，但多项证据表明KIF14是一种癌基因，其在包括肝细胞癌，胃癌，乳腺癌，胶质瘤和卵巢癌等多种类型的肿瘤中过表达[6-12]。此外，KIF14水平是肝细胞癌和卵巢癌独立的预后因素，KIF14过表达促进肿瘤生长，而敲减会降低体外和移植瘤模型的致瘤性[13]。KIF14在PCa中的作用尚不明确，本研究将对KIF14在PCa细胞中的表达及其对PCa细胞的生物学功能的影响进行分析，现将结果报告如下。 　　1材料与方法
　　1.1细胞培养和转染  PCa细胞系22Rv1购自ATCC。将细胞维持在含有10%胎牛血清（FBS），1%青-链霉素和2.5 mM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（Invitrogen）中，在37℃ 5%CO2条件下培养。KIF14-siRNA（siKIF14，Santa Cruz，sc-60882）和对照siRNA（siControl，Santa Cruz，sc-37007）购自美国Santa Cruz 生物技术公司。使用RNAiMAX转染试剂（Invitrogen，13778）根据制造商的说明进行转染。
　　1.2试验方法
　　1.2.1 RNA提取、逆转录和定量实时PCR  用Trizol试剂提取RNA。正常前列腺RNA购自美国Clontech公司。随机六聚体和SuperScript-Ⅲ（Invitrogen）进行逆转录。使用实时PCR Master Mix（SYBR Green）通过Applied Biosystems 7300实时系统进行实时定量PCR。标准曲线用于建立扩增效率[14]，每个实验一式三份，重复3次，使用的所有引物见表1。
　　1.2.2生长曲线  将22Rv1细胞以适当的密度接种在6孔板中，分别用对照siRNA或siKIF14转染细胞。转染后，每24 h计数细胞数，包括起始点。每个实验一式三份，重复3次。
　　1.2.3 Transwell试验  在24孔板中用siRNA转染后，使用Transwell小板（8 μm孔径）评估细胞迁移。在上室中加入含无血清培养基的22Rv1细胞，在下室加入10%FBS培养基，24 h后在显微镜下在至少3个下室随机区域中计数细胞数。结果从至少3次独立实验中获得。
　　1.3统计学分析  所有数据采用SPSS 11.5软件包进行分析。计量资料表示为（x±s）。各组间数据的比较采用t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01表示统计学意义显著。
　　2结果
　　2.1 KIF14在PCa细胞中的表达情况  通过RT-PCR检测PCa细胞系和正常前列腺组织中KIF14的mRNA表达发现，与正常前列腺组织相比，KIF14在LAPC4、22Rv1、LNCaP、DU145、PC3等多个PCa细胞中明显上调（P<0.05），见图1。
　　2.2敲减KIF14对PCa细胞增殖的影响  在用siRNA转染48 h后，RT-PCR分析显示，siKIF14组22Rv1细胞的 KIF14的mRNA水平相比siControl组降低，表达量下降达（88±2）%，差异有统计学意义（P<0.05），见图2A。在KIF14表达被敲减后，siKIF14组细胞增殖相比siControl组在24 h和48 h均降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图2B。这表明敲减KIF14抑制可PCa细胞的增殖。
　　2.3敲减KIF14对PCa细胞迁移的影响  Transwell小室试验检测结果显示，24 h后，siKIF14组细胞迁移数（139.33±28.74）/每视野，较siControl组的（436.00±51.56）/每视野减少，差异有统計学意义（P<0.05），这表明敲减KIF14抑制可PCa细胞的迁移，见图2C。
　　3讨论
　　肿瘤发生是一个复杂的过程，其中包含许多肿瘤抑制基因，癌基因及其相关信号通路的异常破坏。了解PCa肿瘤发生和发展的潜在机制，有利于早期诊断，风险评估和选择针对PCa的治疗策略。本研究将KIF14鉴定为参与肿瘤进展和PCa预后不良的潜在候选癌基因。
　　KIF14是参与细胞分裂，微管聚合物动力学，细胞内转运和信号转导的驱动蛋白家族的成员[3]。越来越多的证据表明KIF14在多种类型的肿瘤中过度表达，包括肝细胞癌，乳腺癌等[7-12]，暗示其作为潜在癌基因的作用。KIF14的上调可能是由基因组扩增引起的[9，12]。据报道，在肝细胞癌中，KIF14的缺失下调Skp2和Cks1的表达，导致p27Kip1的积累。Skp2和Cks1的下调也导致胞质分裂失败，这可能抑制肿瘤生长。抑制KIF14通过HCC细胞中Akt激酶的失活抑制迁移并诱导细胞凋亡[7]。在三阴性乳腺癌中也报道了KIF14对AKT磷酸化的影响[9]。
　　本研究证明，KIF在多个PCa细胞系中表达上调，进一步对从Oncomine数据库，癌症微阵列数据库和综合数据挖掘平台[16]中提取数据，基于来自PCa患者样本的两个数据集的分析[17，18]后可以确定，与正常前列腺组织相比，KIF14在PCa中高度过表达。在PCa细胞22Rv1中敲减KIF14后，细胞增殖和迁移能力均受到明显抑制。这些结果均表明KIF14可能在前列腺癌的发生发展中发挥重要作用，但其促癌作用的机制以及对预后的影响目前尚不明确，有待进一步深入的研究。
　　综上所述，KIF14过表达有助于前列腺肿瘤进展，是潜在的癌基因，KIF14可能是PCa治疗的新靶点。
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　　收稿日期：2019-3-26;修回日期：2019-4-6
　　編辑/肖婷婷
　　基金项目：1.广东省医学科学技术研究基金项目（编号：A2017276）;2.深圳市科创委基础研究自由探索项目（编号：JCYJ20170307095441539）
　　作者简介：袁也晴（1985.9-），男，湖南新化人，博士，主治医师，主要从事泌尿系肿瘤研究
　　通讯作者：张轶庠（1975.10-），男，湖南长沙人，博士，主任医师，主要从事泌尿系肿瘤研究
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