常用支原体检测方法比对研究
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摘 要：支原体污染是细胞体外培养技术中污染发生率很高的世界性难题。2015版《药典》收录的两种支原体检测方法，由于耗时较长，不能满足部分有效期较短的生物制品的检测需求，因此，科研人员想要寻找到准确快速检测支原体的方法。文章总结了我国支原体检测方法的现状，对比了几种支原体快检方法，希望能给科研人员及使用者提供参考。
关键词：支原体;污染;支原体检测方法支原体是一种没有细胞壁的原核微生物，直径约0.13～ 0.18 μm，大小介于细菌和病毒之间，能够透过一般滤膜（0.22 μm），呈高度多形性，有球形、杆状、丝状、分枝状等多种形态。
污染是细胞体外培养技术中面临的主要问题，尤其是传代细胞被支原体污染是世界性难题，在细胞培养中支原体污染的发生率达到63%，支原体污染会改变细胞的DNA，RNA及蛋白表达，但培养液不变混浊，细胞一般也没有明显变化[1]。支原体污染问题是引起各国药品监管机构始终关注的影响生物制品安全性的问题之一。因此，支原体污染检测是生物制品外源因子污染检查的主要检测项目之一，采用细胞体外培养技术制备产品在生产过程的每一步都要进行支原体污染的检查[2，8]。科研人员应该在细胞产品制备的各个阶段都要进行支原体污染的检查，以达到最大限度地降低细胞产品支原体污染的风险及提高产品的安全性的目的。
1 支原体检测方法现状
目前，检测细胞培养物中的支原体有多种方法，常用的有DNA荧光染色法、培养法、免疫学法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、生化法（酶活法，氨基酸分析）、电镜法和聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）等。
我国药典[2]和国际药品监管机构认可的支原体检测方法，也是比较经典的方法，即培养法和DNA荧光染色法。2013年，桂鑫等[3]将荧光染色法和PCR方法相结合，快速检测细胞培养中的支原体污染，并对如何预防进行了探讨。2015年，卢勇等[4]经过实验得出结论，PCR法与酶法检测支原体准确、快速、简便易行，可作为DNA荧光染色法的补充手段。2018年，赵俊鹏等[5]采用DNA荧光染色法作为支原体检测方法，针对医疗放射人员外周血淋巴细胞畸变检测的淋巴细胞培养过程中耐药支原体污染防控，探索不同类别抗生素应用的可行性。
DNA荧光染色法是药典认定的支原体检测的黄金标准，但该方法操作繁琐、环节多、检测时间长，在支原体污染初期，荧光染色效果可能不明显，容易出现假阴性结果。而细胞碎片也可被染色，被误认为是支原体感染，出现假阳性结果。而PCR法与酶法检测准确、快速、简便易行，可作为样本支原体检测的补充手段。
2016年，邢龙彬等[6]以CLARK的一步法试剂、Biotool的快速检测试剂和自行研制的聚合酶链式反应等3种方法，作为细胞培养过程中支原体污染防治的检测方法。2017年，张丹丹等[7]通过RT-PCR方法检测细胞是否存在支原体污染，研究如何有效清除和避免细胞培养过程中支原体的污染，建立细胞培养过程中支原体预防和清除平台。2018年，赵翔等[8]针对我国支原体核酸检测方法学验证的现状提出解决的思路，为我国支原体核酸扩增法检测的研发者提供借鉴。
PCR法是目前支原体检测的常规方法，也是美国FDA认可的检测方法，检测时间相对较短、广谱性强。虽然PCR法检测快速灵敏，但是，也有很多缺点：（1）支原体的特异性引物与衣原体具有同源性，会使PCR检测结果出现假阳性。（2）细胞培养几天后，培养液中会产生严重抑制PCR扩增的代谢物，所以样品前处理是PCR法不可或缺的一个环节。（3）灵敏度有限，通常需要将培养液离心浓缩或者提取DNA后检测。（4）产物需要跑电泳，会用到EB等潜在的致癌物。
2 我国支原体检测方法现状的解决方案
针对国内目前这种现状，科研人员可以优先考虑已经进行过的方法学验证并能够提供验证报告的检测方法或支原体检测试剂盒，但在使用前应该同步开展药典方法的平行检测，经过多次验证并进行数据统计分析后才能代替药典方法。
作为支原体检测领域的共识，单独使用任何一种支原体检测方法，都无法做到100%正确，严格的支原体检测，至少使用两种或两种以上不同原理的支原体检测方法同时进行检测，才能使结果接近100%正确。
[参考文献]
[1]郑向阳，高永忠.细胞传代培养中支原体污染的来源及预防[J].畜牧与饲料科学，2009（1）：49.
[2]国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015.
[3]桂馨，钱洁，许洁，等.细胞培养过程中支原体污染的检测及预防[J].同济大学学报（医学版），2013（3）：24-27.
[4]卢勇，贾继宗，唐静，等.3种支原体检测方法的比较[J].中国生物制品学杂志，2015（10）：1067-1071.
[5]赵俊鹏，杨秋月，蔡超，等.唐山地区医疗放射人员外周血淋巴细胞培养支原体污染的防控[J].职业与健康，2018（16）：2181.
[6]邢龙彬，刘长政，焦晓磊，等.细胞培养过程中支原体污染的防治与检测方法[J].世界华人消化杂志，2016（10）：1557-1564.
[7]张丹丹，郑贝贝，任颜颜，等.山羊成纤维细胞培养过程中支原体污染的去除及预防平台建立[J].黑龙江畜牧兽医，2018（9）：1-5.
[8]赵翔，馮建平，孟淑芳.支原体检查的核酸检测方法及方法学验证的思考[J].中国药事，2018（8）：1020-1027.
作者简介：宋玉民（1988— ），女，天津人，硕士;研究方向：间充质干细胞研发。
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