免疫荧光染色质量影响因素分析

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　　摘要 免疫荧光技术是标记免疫技术中应用最为广泛的一项技术，具有特异性强、灵敏度高、速度快和便于观察等特点。影响免疫荧光染色质量的因素多种多样，从荧光染料、抗体、样品前处理、染色过程等几个重要的方面入手，就如何提高免疫荧光染色质量，以获得一张高分辨率的图片做了详细的介绍。该研究有利于提高免疫荧光染色质量，为生命科学研究提供了有力帮助。
　　关键词 免疫荧光染色技术;抗体;影响因素
　　中图分类号 Q2-33文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）16-0124-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.036
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Influencing Factors of Quality of Immunofluorescent Staining Technology
　　SONG Rui long，ZHOU Zi yan，XU Tian qi et al （College of Veterinary Medicine，Yangzhou University/Jiangsu Co innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou，Jiangsu 225009）
　　Abstract As one of the most widely used immunolabeling techniques，immunofluorescence has several advantages including high specificity，high sensitivity，rapid detection and clear positioning. However，the quality of immunofluorescent staining could be affected by multiple factors，such as fluorescent dyes，antibodies，sample preparation and staining process.Starting with those vital factors，we introduced how to improve the quality of immunofluorescent staining so as to obtain a high resolution image in detail.This study improved the quality of immunofluorescent staining and provided powerful help for life science research.
　　Key words Immunofluorescent cell staining technology;Antibody;Influencing factor
　　免疫荧光染色技术是一种以免疫学为基础，结合生物化学技术和显微技术发展而来的蛋白等分子检测技术。这种技术是Coons等在1941年首先建立的，尤其近三十幾年来，免疫标记技术和检测技术有了长足的进步，其稳定性、灵敏性和特异性都有了飞速的发展。免疫荧光染色技术作为一种科学研究的技术手段，已被广泛应用于细胞生物学、微生物学、寄生虫学、免疫学等科学研究，以及临床诊断方面[1-5]。因此，提高免疫荧光染色质量尤为重要。
　　免疫荧光技术利用了抗原与抗体高度特异性结合的原理，将某种可测定的物质偶联到抗体或者抗原上，通过检测标记物的有无和含量，对样品中待检抗原或抗体进行定性、定位和定量检测。物质原子核外电子具有多个不同大小的能级，最低能级称为基态。当光子能量等于2个不同能级的能量差时，低能级电子吸收光子能量后，跃迁至高能级的激发态。激发态极不稳定，会向低能级状态跃迁，释放出不同能量的光子，这些光子能够通过荧光显微镜检测到，进而对检测物质进行定性、定位、定量等检测[6]。荧光物质在持续受到激发光激发后，由于不能够恢复到基态，从而导致荧光强度减弱或淬灭。免疫荧光染色技术包括试验准备阶段、染色过程和样品拍摄，以下将从荧光染料、抗体、样品前处理、染色过程等方面阐述如何提高免疫荧光染色的质量，以获得高清晰度的图片。 　　1 试验准备
　　1.1 免疫荧光染色方法的选择
　　免疫荧光染色技术分为直接法和间接法。直接法是将荧光标记物偶联在抗原/抗体上，直接与相应的抗体/抗原反应;间接法是先用未标记的一抗与抗原充分反应后，再利用荧光标记的二抗与已经结合在抗原上的一抗结合，达到检测抗原的目的[1]。直接法操作简单、特异性高，非特异性染色少，便于相同宿主来源的不同蛋白的共定位，但是其灵敏性相对比间接法低。间接法相对直接法操作复杂，特异性稍低，但灵敏度高，染色更加灵活，成本低。一般情况下，间接法因上述特点应用更加广泛，而直接法主要应用于流式细胞术或者无法购买到不同宿主来源的一抗时而进行的蛋白共定位检测试验中。
　　1.2 抗体的选择
　　抗原通常包含多个抗原决定簇，抗体按是否由单一抗原决定簇刺激机体产生而分为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是经一种抗原决定簇刺激后的杂交瘤细胞，经HAT培养基筛选，ELISA检测效价，得到阳性克隆株，注射到动物腹水中，收集纯化得到的抗体[7-8]。多克隆抗体只需将具有多个抗原决定簇的抗原直接注射到动物体内进行几次免疫，ELISA测其效价合格后，收集血液离心得到上清，纯化后得到多克隆抗体[9-11]。
　　单克隆抗体特异性高[12]，但因单克隆抗体由单一抗原决定簇抗原刺激得到，所以只能识别一个抗原表位，灵敏度相对较低，且单克隆抗体的抗原表位一旦破坏，将直接影响其与抗原的结合，导致免疫荧光染色的失败[8，13]。另外，单克隆抗体制备过程复杂，价格也相对较高。而多克隆抗体制备过程简单，周期短，价格相对较低[14]。因多克隆抗体由多个抗原决定簇刺激机体得到，所以其能识别多个抗原表位，相同条件下，灵敏度更高，对于表达量较低的目标蛋白更容易检出。另外即使少数多克隆抗体的抗原表位破坏，免疫荧光染色的结果也不会受到影响。但是，因为其能识别多个抗原表位，所以其特异性也相对较低。
　　综上所述，与目标蛋白直接结合的一抗，在条件允许的条件下，尽量选择相同来源的免疫原或者选择已验证种属反应性的抗体[15]。如果进行不同目标蛋白的双染或多染时，这些不同蛋白所对应的一抗应该来源于不同宿主。单克隆抗体与多克隆抗体、种属免疫原、反应性和抗体的宿主来源是抗体选择最主要考虑的因素，其直接决定着免疫荧光染色的背景、特异性和成败。荧光偶联的二抗应选择与一抗相对应的抗体，及抗一抗的二抗[16]。
　　1.3 荧光染料的选择
　　随着免疫荧光技术的不断进步，免疫荧光染料也得到了飞速的发展，目前市场上常用的荧光染料有Alexa Fluor 系列、CFTM系列、ATTO系列、DyLight系列和Cy系列等，使用最多的是Alexa Fluor 系列和CFTM系列[17]。
　　染料的选择应与激光共聚焦显微镜所配激光器的激发波长相匹配（350、405、458、488、514、561、633 nm），当需要多重荧光标记时，这些荧光探针的激发波长或发射波长尽量相差大些，可以区分开。350 nm或者405 nm激光器激发的蓝色染料有CF 350、Alexa Fluor 350、CF 405S/ CF 405 M和Alexa Fluor 405等。488 nm激光器能够激发绿色荧光，常用荧光染料有CF 488A、Alexa Fluor 488、FITC、FAM、DyLight 488和Cy2等。其中FITC荧光强度极易受到pH影响，且易淬灭，在荧光染料选择中，常用Alexa Fluor488或者CF 488A替代。543～555 nm激光器能够激发橙红色荧光，染料有CF 543、Alexa Fluor 546、ATTO550、Cy3、DyLight 549、Rhodamine （TRITC）[18]。568～594 nm激光器激发红色荧光，染料有CF 568、Alexa Fluor568、ATTO 565、Rhodamine Red等。620～660 nm激光器激发远红外荧光，染料有CF 620R、LightCycler Red 640等。680～790 nm激光器激发近红外荧光，染料有CF 680R/680、Alexa Fluor 680、IR Dye 680等[19]。
　　在进行双重或多重免疫荧光染色时，一般先通过ThermoFisher等网站上的荧光光谱查看器进行预选择，不同荧光的激发波長或发射波长尽量无交叉，防止串色，影响试验结果的准确性。荧光染料各有各的特性，Alexa Fluor 系列荧光染料激发和发射光谱窄，且在较宽的pH范围内保持稳定（pH4～10），可用于双重或多重荧光染色而光谱重叠少[20]。ATTO 系列荧光染料具有较强的光稳定性和热稳定性，已被应用于STED （stimulated emission depletion，受激发射损耗） 超高分辨率显微成像技术[21]。DyLight、CF 等具有较高的激发效率、良好的光稳定性和pH 稳定性等，从而被广泛应用于组织及细胞免疫荧光染色[20]。
　　1.4 抗体保存
　　应该防止荧光抗体失活、污染以及荧光染料的脱落和淬灭。在抗体保存过程中，适量分装，避免反复冻融。蛋白极易被塑料等吸附，如果用塑料管分装，抗体中应添加BSA等。为防止污染也可以添加0.01%的硫柳汞或者0.1%的叠氮化钠。为防止淬灭，保存荧光抗体时应该注意避光，可以利用锡箔纸包好，或者放在避光的容器中。 　　1.5 培养载体的选择
　　根据贴壁情况，细胞可分为贴壁细胞和悬浮细胞。贴壁细胞一般常用24孔细胞培养板培养，接种细胞前放置0.17 mm玻璃细胞爬片。悬浮细胞常用6孔板培养，免疫荧光染色处理后，取少量加在0.17 mm玻璃细胞爬片上。最后将细胞爬片倒扣到载玻片上，封片，放4 ℃保存。
　　2 免疫荧光染色
　　免疫荧光染色流程主要包括细胞固定、透膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、封片以及每一步之间的洗涤等。
　　2.1 细胞固定
　　细胞固定是为了尽可能地使细胞形态结构和物质组成保存原有状态，防止细胞死后发生自溶或破坏，以便最大程度地反映固定前的生命活动，同时对细胞自身也起到了一定的固定作用[22]。
　　免疫荧光染色常用的固定剂有甲醛、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇、甲醇等[23]。多聚甲醛较甲醛稳定，不易析出[24];4%的多聚甲醛在细胞免疫荧光染色中最为常用[25-28]。在进行破骨细胞骨架免疫荧光染色试验中发现，4%的多聚甲醛固定20 min效果显著好于其他固定剂的固定效果。因其易分解，4%的多聚甲醛最好现配现用。丙酮的组织穿透性强，可使蛋白沉淀，抗原固定较好，但对核固定较差，固定效果弱于多聚甲醛，且使细胞收缩严重。95%乙醇脱水性强，但同时也易引起组织收缩、变硬，能沉淀白蛋白、核蛋白和球蛋白等，也较为常用。甲醇的固定时间快，细胞收缩小，细胞核保存较戊二醛的反应速度快，是优良的前固定剂，但它的渗透速度较慢。尽管如此，不同蛋白各有其适应的固定剂。
　　2.2 透膜处理
　　Triton X-100作为免疫荧光染色最为常用的透膜剂，其实质是一种非离子型表面活性剂，能够溶解脂质，增强细胞膜的通透性，便于抗体进入细胞内[29]。如果需检测的目的蛋白属于胞内蛋白或者抗原抗体结合位点位于胞内的跨膜蛋白，抗体孵育前需进行透膜处理[27]。对于一些抗原抗体结合位点位于胞外膜上的目标蛋白，是否进行透膜处理对试验结果影响不大。
　　Triton X-100浓度和透膜时间并非越大或越长越好，在破骨细胞骨架免疫荧光染色试验中，0.5%的Triton X-100透膜处理20 min效果最佳。时间过短或浓度过低，会造成透膜不充分，抗体进入胞内不足，荧光强度低，图像不清晰。相反，Triton X-100浓度过高或透膜时间过长都会造成细胞骨架结构解离，致使显微镜下无法检测到骨架结构或只检测到少量蛋白残基。
　　2.3 样品封闭
　　封闭处理的目的通常是减少抗体的非特异性结合，如非特异性抗体与内源Fc受体（FcR）结合或与其他物质之间的离子作用或疏水作用等[12]。最常用的封闭液有1%～5%的BSA溶液、脱脂奶粉溶液或血清溶液[30]。尽管如此，Buchwalow等[31]研究发现内源性FcR在标本固定后失去结合抗体Fc部分的能力。 同样，也没有发现任何离子作用或疏水作用的非特异性抗体结合，因此认为传统意义上的样品封闭步骤在免疫荧光染色中是没有必要的。
　　2.4 抗体孵育
　　抗体孵育目的是使抗体充分与目的蛋白抗原结合，其结合程度直接影响着免疫荧光染色的效果。抗体浓度一般按照说明书推荐进行适当调整。通常37 ℃孵育 1～2 h，可根据蛋白表达量的多少适当调整时间，或者一抗4 ℃过夜。一般情况下，环境温度的升高对免疫荧光染色有明显的影响，随着温度升高，荧光淬灭的可能性增大，因此适当的低温环境对于免疫荧光染色和观察效果更好。
　　2.5 洗涤
　　在细胞进行固定处理前要用37 ℃ PBS洗涤3遍，每遍1 min，以减少细胞的应激和去除附着的杂质[19]。固定后和透膜后各洗涤3遍，每遍2 min，去除其中的固定剂和Triton X-100，封闭后的封闭液无需洗涤，只需用移液器吸净[27]。孵育二抗前，要充分洗净一抗，防止二抗与残留的一抗结合，影响结果的准确性，也可减少背景色。二抗孵育结束后，再充分洗涤残留的二抗。
　　2.6 封片
　　封片时添加少许防淬灭剂可防止样品淬灭。但并不是每种防淬灭剂都适合免疫荧光染色。常用甘油和PBS等量混合，因每种荧光染料适应于不同的pH，建议封闭液使用前调整pH直至荧光染料的最适pH。目前商品化的防淬灭剂有Prolong Gold、Mowiol、Vectashield和DABCO/NPG等。Prolong Gold （life tech）含有防淬灭剂，封片后需要硬化一段时间， 可长期保存;Mowiol封片后可长期保存;Vectashield具有部分自发荧光，且会影响一些染料的光谱特性;而DABCO/NPG会严重影响某些染料的光譜特性，宜谨慎 使用。
　　2.7 pH
　　荧光素在溶液状态下基本处于离子化状态，故维持荧光素与溶剂之间的电离平衡至关重要。溶液的pH对免疫荧光强度影响极大，不同的荧光素标记物都有自己适合的pH，pH改变能够影响荧光素的荧光强度，在进行免疫荧光染色时要注意荧光素标记物适宜的pH。
　　安徽农业科学2019年
　　3 结语
　　免疫荧光染色技术是生命科学研究中极其重要的工具之一，自Coons等首次使用荧光素标记的免疫组织化学法以来，目前已被广泛应用于各个领域。随着各种荧光标记物的快速发展和超分辨激光共聚焦显微镜的普及，其已不再受到光的衍射原理的限制，突破了分辨率最高不超过220 nm的限制，将分辨率提高到了1个纳米，为生命科学研究提供了强有力的技术工具。免疫荧光染色的好坏直接关系到免疫荧光染色结果的分辨率高低和准确性等。该研究详细分析了免疫荧光染色过程中抗体选择、染料选择等试验前期准备过程以及封闭、透膜、染色等染色过程中各个主要因素的影响，有利于提高免疫荧光染色的质量，为生命科学研究提供有力帮助。 　　参考文献
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