草莓脱毒技术研究进展

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　　摘   要  草莓味道甜美、营养丰富，还有较高的药用价值，深受广大消费者的喜爱。但草莓病害较多，生产用药较为频繁，严重影响了果实食用安全性。随着消费者的食品安全意识不断提高，对草莓的品质也提出了更高的要求。脱毒苗的应用满足了绿色农业及草莓产业现代化发展需求，对产业兴旺起到积极促进的作用。从组织培养脱毒、热处理脱毒、超低温脱毒等方面综述草莓脱毒技术研究进展，并提出展望。
　　关键词   草莓;组织培养脱毒;热处理脱毒;超低温脱毒
　　中图分类号：S668.4    文献标志码：C    DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.25.009
　　近年来，在发展特色效益农业政策的引导下，草莓产业发展越来越受到新型农业经营主体的青睐和重视，草莓种植面积日益扩大，随之而来的病害发生日渐频繁，植株矮化、产量下降、品质变劣等负面效应接踵而至[1]。目前，已报道的草莓病害有25种之多，造成草莓大幅减产，经济损失巨大[2]，其中已查明的4种病毒病严重威胁着草莓产业的发展：草莓斑驳病毒病、草莓轻型黄边病毒病、草莓镶脉病毒病、草莓皱缩病毒病[3]，植株一旦染病，很难防治。目前，草莓脱毒苗的增产效应日益凸显，与常规苗相比，脱毒苗的抗病性强、苗株高、长势强、产量好、果实可溶性固形物含量高[4]，因此，培养和推广脱毒苗是提高草莓产业经济效益的必经之路。本文围绕草莓的这4种主要病毒病，从组织培养脱毒、热处理脱毒及低温处理脱毒等技术展开综述。
　　1 草莓组织培养脱毒
　　组织培养脱毒是获取无毒苗的一条重要途径，在对患病草莓有效脱毒的同时，还可以保持亲本的优良性状，提高繁育能力，该技术已在生产实践中得到了广泛应用，通常选取茎尖或花粉进行培养。
　　1.1 草莓茎尖培养脱毒
　　茎尖培养脱毒是在无菌环境下切取适当茎尖生长点接种于最佳诱导培养基上，进行离体培养获得无毒苗的一种方法，茎尖的大小选取直接关系着培养及脱毒效果，因为病毒在没有植物维管束的分生区域内，需依靠胞间连丝进行传递，但由于分生区域的细胞分裂、生长速度较快，病毒的传递速度远不及其活跃程度，所以生长点带病毒含量极低[5]。同时，茎尖中内源生长素含量对病毒增殖起到很好的抑制作用，这也是茎尖被广泛用于植物组织培养外植体的重要原因[6]。1962—1963年，Belkengren[7]、Miller[8]等人首次采用茎尖培养获得草莓脱毒苗;1984年，国内邓明琴等人[9]采用草莓茎尖组织培养获取无毒苗取得了初步成效。此后，草莓的茎尖培养脱毒技术便取得突飞猛进的发展。针对草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓镶脉病毒、草莓皱缩病毒这4种常见病毒，张志宏等人[10]采用茎尖培养、热处理、药剂处理三种脱毒方法，比较评价了其脱毒效应，结果表明取0.5 mm茎尖作为外植体进行组织培养是获得草莓无毒苗最适宜的办法，病毒脱除率及分化成苗率均达到70%以上。杨波等人[11]取0.4 mm茎尖接种于MS培养基进行诱导培养，经检测发现：组培苗中轻型黄边病毒和斑驳病毒的脱毒率为100%，镶脉病毒的脱毒率为82%，表明单纯的茎尖培养对脱毒效果仍有一定的局限。高遐虹等人[12]采用茎尖二次脱毒的方法，4种病毒的脱除率达100%。茎尖培养及重复茎尖培养虽然是获得无毒苗的有效手段，但存在耗时长、工作效率低的问题，探索更高效、更便捷的脱毒方法势在必行。
　　1.2 花药培养脱毒
　　花药培养脱毒是将植物体发育到一定阶段的花药，接种于适宜的诱导培养基上，形成愈伤组织，从而分化成完整无毒植株的过程。有研究表明花药培养脱毒率之所以能达到100%，是由于病毒难以到达花药等繁殖器官[13]。同时，花药培养形成的脱毒苗生长势强、耐热能力强、生长健壮，故花药组织培养已成为获得无毒苗的重要手段[14-15]。1974年，日本大泽胜次[16]首次发现花药可培养产生无病毒植株，这一发现开启了花药培养的“一扇大門”，此后，花药培养方法日渐成熟。研究发现花蕾的大小直接关系着花药的发育情况[17]。一般情况下，草莓花药单核期为培养的最佳时期，此时花蕾直径约为4 mm，是诱导愈伤组织和分化不定芽的最适宜时期，诱导率比花粉发育初双核期高6倍左右[18]。龙照春等人[19]对比了茎尖培养、花药培养、幼叶培养、愈伤组织诱导及分化、加热处理等几种方式的脱毒效率，发现花药培养脱毒率可达100%，其愈伤组织诱导培养基为LS+2 mg·L-1 BA+0.5 mg·L-1 NAA，诱导率可达92.8%;不定芽的诱导培养基为LS+2 mg·L-1 BA+0.3 mg·L-1 NAA，分化率10%;生根培养培养基为MS+0.2 mg·L-1 IBA，生根率100%。花药培养虽在组培脱毒苗应用中具有明显优势，但花药再生遗传变异是一个客观存在的问题，需要探索一套标准化的技术流程或数据库系统来解决[20]。相对而言，花药培养再生率较低，在花药接种前，如将目标花蕾离体做低温处理，花药愈伤组织出愈率将会得到显著提高[21]。研究发现最适花药低温处理时间为
　　72 h，出愈率能达到58%[22]。
　　2 热处理脱毒
　　热处理脱毒是根据病毒粒子对高温耐受程度的不同，采用不同的处理温度，使病毒钝化失活。单纯的热处理脱毒要结合病毒本身耐受性做适当温度调整，草莓斑驳病耐热性较弱，37～38 ℃恒温处理10～14 d;草莓镶脉病耐热性较强，42 ℃处理10～14 d;草莓皱缩病有很强的耐高温性，38 ℃恒温处理或35～41 ℃变温热处理数周才可以达到较好脱毒效果 [23]，整体来看，工作效率较低。1960年下村指出，取0.3 mm以下的茎尖，结合热处理方法，将可能达到100%的脱毒效果，这一发现克服了单纯热处理脱毒和茎尖脱毒的时间问题和技术问题，实现了互补效果。刘健[24]、李志强[25]等人切取40 ℃水浴4 h后的0.3～0.5 mm茎尖进行培养后检测，发现4种病毒全部脱毒。陈英等人[26]发现，经高温处理后，取茎尖长度为0.2～0.3 mm，脱毒效果较好;当茎尖长度为0.5～0.8 mm时，仅SVBV病毒未脱除，可能和其耐热性有关[27]。研究发现，先进行茎尖培养后再做热处理，脱毒率及成活率将显著提高[28]。 　　有些學者将热处理和低温处理混合使用，在保证脱毒效果的同时，进一步降低了对茎尖大小选取的限制，可将茎尖选取范围扩大到1.0～1.5 mm，其再生率和病毒脱除率分别可达到33%～76%和30%～100%[29]。
　　3 超低温脱毒
　　超低温脱毒是将植物离体材料预处理后置于液氮中做冷冻处理，后经解冻再生的一种技术，可实现植物脱毒和种质资源保存的双重目标。超低温脱毒的理想材料一般为经低温处理后遗传性状较为稳定的分生组织、茎尖等[30]。与传统方法相比，超低温技术的脱毒率较高，且不依赖于茎尖大小[31]，有效克服了茎尖培养脱毒的技术难题[32]。盛宏亚[33]、蔡斌华[34]取1～2 mm带病草莓茎尖，利用玻璃化超低温分别在脱除草莓斑驳病毒及草莓轻型黄边病毒两类单一病毒方面取得较好的效果，脱毒率在95%以上，但该方法的不足之处是存活率较低。罗娅等人[35]探索出了一套既能保证成活率，又能有效脱除病毒的超低温体系：在0.3 mol·L-1蔗糖溶液中暗培养7 d，室温下60%PVS2装载60 min，然后在0 ℃下用100%PVS2玻璃化处理60 min，再用液氮处理1 d后，38～40 ℃水浴2 min，成活率可达68.89%，病毒脱除率100%。其中，PVS2处理是关键性技术，处理不当将会严重影响茎尖成活率。在草莓脱毒的整个过程中，要经历低温、渗透、有氧等一系列逆境，可能会使草莓遗传信息发生一定的变化。朱文涛等人[36]采用AFLP和MSAP技术对超低温技术处理后的草莓做了遗传稳定性研究，AFLP技术分析说明超低温处理后草莓未发生遗传变异，MSAP技术进一步分析发现超低温后草莓DNA甲基化与去甲基化分别为5.70%和12.43%，遗传稳定性受到了一定程度的影响，也有学者认为这可能是一种逆境适应表现[37]。
　　4 展望
　　草莓病毒病大多为复合病毒感染，单一应用茎尖脱毒、花药脱毒、热处理脱毒、超低温脱毒方法，不能达到很好的效果，一般情况下会采取多种方法混合使用，严格来讲，还要注意切取目标的大小、时间、形态，操作较为繁琐。而目前，化学药剂脱毒、原生质体培养脱毒研究相对较少，在今后的研究中，可进行探索性研究，进一步拓宽脱毒手段。传统的方法在操作等方面具有一定的局限性，而植物基因工程的发展，为草莓品质化发展开辟了新天地，例如Katchen Julliany P. Silva[38]等人利用拟南芥模型中发现的一种被称为系统获得抗性（SAR）的自然抗病机制，将拟南芥NPR1基因（AtNPR1）导入二倍体草莓中，获得了对炭疽病、白粉病和角化叶斑病具有抗性的草莓株系。该方法从理论上可选择多种抗性基因来抵御各类病毒的侵染，发展潜力巨大。同时，也可探索通过注射病毒疫苗来增强苗木本身对病毒的免疫能力，从而减少病害的发生。总之，草莓脱毒在技术上虽然取得了一定的进展，但是更简单、易操作、更长久的脱毒方法还需要进一步探索，脱毒技术研究工作任重而道远。
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