独山石楠幼茎的离体组织培养
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摘要：以独山石楠属的幼茎作为外植体，对其进行愈伤组织的诱导与分化、幼芽增殖、生根培养等技术的较为系统的研究。
关键词：独山石楠;幼茎;组织培养
中图分类号：S-3
文献标识码：A
DOI：10.19754/j.nyyjs.20200215024
收稿日期：2019-12-24
作者简介：赵立军（1974-），男，讲师，硕士。研究方向：转基因植物、植物组织培养等。
独山石楠不仅具有观赏性，还具有药用价值，市场需求量大，但我国的独山石楠主要以国外引进为主。面对国内苗圃公司对独山石楠苗木的需求，通过组织培养建立经济、有效的繁殖体系，能有效适应市场需求，对培育具有我国自主产权的苗木具有重要的意义。
以MS作为组培的基本培养基，通过相关技术手段，记录独山石楠腋芽的消毒时间、植物激素比例、初代培养、继代培养的相关数据，试着建立独山石楠的组培技术方法与规范。
1 独山石楠的组织培养
1.1 实验原材料
独山石楠的腋芽。于2018年7月15日在独山县采摘的独山石楠的腋芽部位作为外植体，用于建立独山石楠的快速繁殖体系。
1.2 组织培养
1.2.1 实验材料预处理
将带腋芽的枝条剪去多余的茎和叶，分割成包括腋芽在内的茎段，约为1.5cm左右，用4.9%的洗洁精水溶液浸泡18min，把茎段用镊子夹到事先备好的容器中，放在流水下洗涤2.5h备用。
1.2.2 对腋芽的消毒
把经过预处理后的独山石楠腋芽置于容器中，经过紫外杀菌35min后，往容器内置入浓度为75%的乙醇消毒35s，然后用无菌水冲洗4～5次备用。取出腋芽置于浓度为0.1%HgCl2消毒剂中消毒。设置不同的时间梯度进行不同的处理，最后得到不同消毒时间对外植体发芽成活率的影响结果，20d后统计污染率及萌芽率。
1.2.3 进行初代培养
进行初代培养采用NAA、6-BA 2种植物激素，以2种植物激素及不同浓度的配比作为自变量，筛选出最佳的初代培养基。取消毒后的多个腋芽，分别接种在不同激素及不同浓度配比的培养基中，每组各处理15个，采用正交试验设计。23d后统计丛生芽萌芽率、芽高及生长情况。
1.2.4 进行继代培养
进行继代培养采用NAA、6-BA、IBA、KT 4种植物激素，用4种植物激素、不同浓度的配比作自变量，来筛选最优的继代培养基。将从初代培养基中培育得出的丛生芽，接种在不同植物激素及不同浓度配比的继代培养基内，每组各处理15个，仍然采用正交试验设计方案。23d后统计萌发率、芽高、生长情况。
1.3 实验结果及分析
1.3.1 对独山石楠腋芽的消毒处理
在无菌操环境中用浓度0.1%的HgCl2对独山石楠的幼茎腋芽进行消毒时，以消毒时间（5min、8min、10min）为自变量，把消毒后的幼茎腋芽接种在配制好的初代培养基上进行培养，23d后统计污染率、萌发率。
从实验结果看，消毒用时对独山石楠腋芽诱导发芽成活率有极其显著的影响。如果对腋芽消毒不到位，会引起大面积污染情况。用0.1%HgCl2对独山石楠腋芽进行消毒处理时，时间太短会导致腋芽消毒不彻底，致使污染率太高;但是消毒时间太长又会导致HgCl2对腋芽的组织及其表层细胞造成不同程度的伤害，最后造成独山石楠幼茎的腋芽损伤，甚至使其死亡，导致死亡率增高。
方差分析结果可以看出，消毒时间长短对腋芽发芽率的影响有着显著差异性（P=0.042），但对污染率的影响没有显著差异性（P=0.059）。而且在用HgCl2对腋芽消毒的过程中，可以看到发芽率会随着消毒时间的延长而逐渐下降，所以对独山石楠腋芽的最佳消毒时间是 8min。
1.3.2 进行初代培养
对腋芽用0.1%HgCl2消毒8min，分别接种到处理分组中，每组各处理12个，统计丛芽的发芽率，选择芽量芽高作为观察指标，观察芽的生长状况，如表1所示。当腋芽接种到初代培养基后9d，腋芽处长出嫩黄色的芽点，其插在初代培养基的叶柄处会开始膨胀，萌发愈伤组织。
进行方差分析后，筛选出2种不同植物，叶片比较大，出芽量比较少，愈伤组织多，不同激素及不同浓度比例对独山石楠腋芽的发芽率没有显著差异性（P=0.061），对芽高的影响有显著性差异性（P=0.042），因此2种不同植物激素浓度的比例对独山石楠腋芽的生长影响比较大。NAA和6-BA都是诱导独山石楠腋芽萌发和生长的主要因素，其中6-BA在腋芽萌发率中起着主效应的作用，随着6-BA浓度的升高，腋芽萌发率也随之而升高，但是随着生长素NAA浓度的增加，发芽率呈现先升高后降低的趋势。生长素NAA浓度的变化也会影响腋芽的发芽率，出现了先升高后又降低的趋势。6-BA也是影响伸长生长的因子，随着6-BA浓度的增加，平均芽高也随之而增加。在对初代培养中这9种实验处理分组的结果观察过程中，可初步得独山石楠腋芽的启动培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+琼脂9g/L+蔗糖30g/L，PH=6.0。
1.3.3 进行继代培养
继代培养基中不同植物激素的不同浓度配比对丛生芽的增值有不同的影响结果，见表2所示。
在处理组1～3中，当使用液体浓度不变时，会导致其他植物激素浓度逐渐增加，增值倍数和有效芽率、芽高都出现先升后降，其中第2组达到最高，增值倍数为0.67，有效芽率为87.5%，芽高达到2.15cm。处理组4～6中，其增值倍数和有效发芽率、芽高都呈现了逐渐降低的趋势，在第4组中达到最低，增值倍数为1.00，有效芽率为83.3%，芽高为2.15cm。处理组7～9中，随着植物激素浓度的升高，其增值倍数渐低，有效芽率呈增加趋势，在第9组中达到最大为66.7%。第2、4、9处理分组中，第4处理组的效果是最好的，有效芽率达到83.3%，其组培瓶中组培苗生长健壮，根基部有较多的愈伤组织，有利于组培苗的生长。通过方差分析可得出，不同植物激素浓度配比对独山石楠外植体的增值倍数的影响有显著差异（P=0.032），对发芽数的影响无显著差异（P=0.058），对芽高的影响有显著差异（P=0.034）。可初步得出，独山石楠继代培养基为MS加1.0mg/L 6-BA加0.05mg/L NAA加2.0 mg/L KT加0.1mg/L IBA加蔗糖30g/L加琼脂9g/L、PH=6.0。
2 对实验结果的讨论
2.1 不同消毒时间对外植体腋芽消毒效果的影响
植物组培过程中最大的难点是控制污染，组培过程中，操作环境、组织切段、接种用的各种工具、各种培养基、接种过程中每个步骤是否按常规进行操作都可能引起不同程度的污染。如何在接种过程中降低污染率，最大程度地提高成活率，便于进行各个阶段的组培，减小实验误差，消毒这个流程在组培过程中占有重要的地位。
從野外采摘的独山石楠带腋芽附着很多微生物，那么选择消毒剂就至关重要。要除掉茎段外体的微生物，不能损害茎段本体上的腋芽，腋芽需放入无菌水中彻底清洗，否则会影响最后实验结果。在组培全过程中，消毒时间对腋芽的影响也很大，如果消毒时间不足，导致消毒不彻底，在后续的组培过程中可能导致高污染率，影响最后组培的结果;如果消毒用时过长可能会导致腋芽失去活性，最后影响组培的结果。所以，消毒时间长短对腋芽的组培起着至关重要的作用。
2.2 不同种类的植物激素及不同浓度的植物激素在初代培养中的影响
培养独山石楠组培苗的各种环境条件、所用的培养基等都会影响腋芽组培的最终结果，而组培过程中诱导脱分化、生根和发芽的植物激素发挥着不可替代的作用。不同种类的植物激素及激素的分配比例，对诱发植物体内细胞分裂的活动，促进萌发，促进芽和根的发育和生长起着非常重要的作用。在初代培养基及继代培养基中加入不同植物激素的比例会影响到愈伤组织是先生芽还是先生根。
参考文献
[1] 何家涛.独山石楠离体培养与高效再生体系建立[J]. 湖北农业科学， 2010， 49（7）：1553-1557.
[2] 李幸红.红叶石楠（Photinia fraseri）的组织培养及其3种药用成分含量研究[D].郑州：郑州大学，2016.
（责任编辑 贾灿）
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