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响应面法优化草莓品种红颜离体繁殖的增殖条件

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  摘要:为了研究优化红颜草莓继代增殖培养的条件,以草莓品种红颜继代组培苗为试验材料,利用响应面法对其增殖条件进行优化。在单因素的试验基础上,根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理,以琼脂浓度、光照度、pH值为试验因子,以增殖系数为响应值,进行3因素3水平的试验设计。结果表明:3因素对植株增殖系数的影响力大小为光照度>pH值>琼脂浓度,最终得到的二元回归方程显示,红颜草莓增殖条件的优化结果如下:琼脂浓度为 7.1 g/L,pH值为5.37,光照度为2 177 lx。在此条件下,最佳增殖系数预测值为10.930 5,实际操作结果为10.73。
  关键词:草莓品种;离体繁殖;增殖条件;响应面法
  中图分类号: S668.404+.3 文献标志码: A 文章编号:1002-1302(2019)23-0088-04
  草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科草莓属多年生草本植物,红颜(Benihoppe)为著名的日本品种,是以幸香和章姬为亲本杂交选育而来的,其果实鲜红饱满,味道香甜可口,产量高,耐储存耐运输[1],深受广大种植者和消费者的喜爱,具有较高的经济价值,拥有广阔的市场。草莓的传统繁殖方法是匍匐茎繁殖和分枝繁殖,效率低,易感染病毒,长久的病毒累积使品种退化,产量降低[2]。经过茎尖脱毒培养后进行离体快繁,不受季节限制,产量高,培养周期短,是获得大量无病毒原种苗的有效手段。
  目前,关于草莓组培的相关研究,大部分集中于探讨培养基内激素的种类及浓度,旨在筛选出每个阶段的最佳培养基[3-7],但关于其他培养条件的优化研究鲜有报道。本试验旨在探讨增殖阶段,pH值、光照度、琼脂浓度对其增殖率的影响。并在单因素的试验基础上,参考Box-Behnken的中心组合试验设计原理,用响应面法将各因子的相互关系进行拟合分析,研究各因子与响应值的关系,从而优化红颜草莓的组培条件,以期为今后相关研究提供理论实践基础。
  1 材料与方法
  1.1 试验材料
  试验材料为吉林农业大学温室的当年生草莓匍匐茎尖,于2017年5月采摘,在园艺学院园林生物技术实验室内经初代培养后,选取长势一致的、高2 cm左右的红颜草莓继代组培苗为试验材料。在预试验的基础上,所用的培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L,蔗糖浓度30 g/L。
  1.2 试验方法
  1.2.1 单因素试验
  1.2.1.1 pH值对增殖系数的影响 将不定芽接种到培养基内,光照度为2 000 lx,光照时间为14 h/d,培养室温度为 (25±2) ℃,pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,琼脂粉浓度为 7 g/L。每个水平处理10个组培苗,培养周期为30 d。
  1.2.1.2 光照度对增殖系数的影响 将不定芽接种到培养基内,pH值为6.0,光照时间为14 h/d,培养室温度为(25±2) ℃,光照度为1 200、1 500、1 800、2 100、2 400 lx。琼脂粉浓度为7 g/L,每个水平处理10个组培苗,培养周期为30 d。
  1.2.1.3 琼脂浓度对增殖系数的影响 将不定芽接种到培养基内,pH值为6.0,光照时间为14 h/d,光照度为2 000 lx,培养室温度为(25±2) ℃,琼脂浓度为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 g/L,每个水平处理10个组培苗,培养周期为30 d。
  1.2.2 响应面优化试验 在单因素试验的基础上,用响应面分析法,根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理,以pH值、光照度、琼脂浓度为试验因子,增殖系數为响应值,进行3因素3水平的试验设计,见表1。每个水平处理10个组培苗,培养周期为30 d。
  1.3 数据分析
  用SPSS和Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析。增殖系数=培养30 d后不定芽总数/接种的不定芽数。
  2 结果与分析
  2.1 单因素试验结果
  2.1.1 pH值对增殖系数的影响 由表2可知,pH值为5.5时,试管苗呈翠绿色,植株健壮,与其他大部分处理间差异显著。当pH值为6.0时,增殖系数随着pH值的继续升高而降低。当pH值为7.0时,培养基内环境为碱性,增殖系数只有3.30,植株矮小,长势不佳。由此可见,草莓增殖阶段更适于酸性的培养环境,碱性环境会抑制其增殖与生长,增殖培养的最适pH值为5.5,增殖系数可达5.90。
  2.1.2 光照度对增殖系数的影响 由表2可知,增殖系数随光照度的增大呈先上升后下降的趋势,在光照度 1 200 lx 下,试管苗生长缓慢,长势不佳,增殖率只有3.1。随着光照度的增加,植株长势随之变好,增殖系数随之增加,但光照度为2 400 lx时,增殖系数下降,且试管苗失绿变透明状,有玻璃化现象。由此可见,光照度过低会抑制植株生长,过高会产生玻璃化苗,不利于植株生长,增殖培养的最佳光照度为 2 100 lx,增殖系数为6.90。
  2.1.3 琼脂浓度对增殖系数的影响 由表2可知,琼脂浓度低于7.0 g/L时,增殖系数都低于5,植株矮小且有玻璃化苗产生。当琼脂浓度≥7.0 g/L时,植株生长健壮,无玻璃化苗。C4、C5这2处理差异不显著,都有很好的增殖效果,且植株长势极佳,但从经济成本上考虑,筛选出最适宜增殖培养的琼脂浓度为7.5 g/L,增殖系数为6.50。
  2.2 响应面优化试验结果
  2.2.1 二元模型的建立与分析 以增殖系数(Y)为响应值,琼脂浓度(X1)、pH(X2)、光照度(X3)为因素,经过Design-Expert 8.0.6软件分析,得出的回归方程模型为Y=10.66+0.36X1-0.89X2+1.00X3+0.33X1X2+0.050X1X3+020X2X3-0.89X21-1.54X22-1.87X23。该回归模型P为 0.000 3<0.01,有极显著差异,失拟项为0.174 6>0.05,差异不显著,模型稳定性较好。该方程响应面试验设计与结果见表3。R2=0.962 6,说明方程拟合性良好,试验误差小。由表4可知,X1对响应值影响不显著,X2、X3影响极显著,3因素对增殖系数的影响力大小为X3>X2>X1,X1、X2、X3的二次项都对响应值有极显著影响,交互作用影响均不显著。   2.2.2 响应面分析 根据拟合方程,绘制3因素之间交互作用的响应面图和等高线图,各图表示在1种因素取值为0时,其他2种因素对响应值的影响。响应面曲面的陡峭程度可表明因素对响应值的影响力大小,曲面越陡,影响力越大,反之则越小。由等高线的形状可知交互效应的强弱,椭圆形表明效应显著,圆形则相反[8]。由图1、图2、图3可知,有关琼脂浓度的曲面较平缓,可见琼脂的影响力小。关于光照度的曲面都很陡峭,可见光照度是影响力最大的因素。通过等高线图及响应面图可见琼脂浓度与pH值的交互作用影响力最大,其次是光照度与pH值,影响力最小的是光照度与琼脂浓度的交互作用。
  2.2.3 模拟方程的验证试验 通过二次回归方程的分析可得出红颜草莓增殖的最优条件如下:琼脂浓度为7.08 g/L,pH值为5.37,光照度为2 176.99 lx,最佳增殖系数预测值为10.930 5。对该模型进行3次验证试验, 试验条件如下:琼脂浓度为7.1 g/L,pH值为5.37,光照度为2 177 lx。每次处理10个不定芽,得出的3次结果为10.7、11.2、10.3,平均值为10.73。与预测值十分接近,说明方程与真实试验拟合度较好,该优化方案有实际意义和可行度。
  3 讨论与结论
  光照度是影响植物光合作用的主要因素,在一定范围内,随着光照度的增强, 植株长势随之变好。但光照度超过一定
  范围,则会对植物产生不利影响[9]。不同种类的组培苗所需光照差异性较大,如红树莓增殖阶段的最适光照度为 1 500 lx[10],紫花含笑在8 000 lx的强光下更适于芽的生长[11],金叶复叶槭在4 200 lx的光照度下生长效果最佳[12],香蕉组培苗增殖阶段只需1 000 lx光照度[13]。在组培的不同阶段,所需光照度不同,通常在生根阶段组培苗所需的光照更多,随着组培苗生长状态的变化,要合理调控光因素,才可使植株更好生长,可见光照是影响组培苗生长的重要因素。不同植物所需的培养基酸碱环境不同,本试验证明,红颜草莓更适于酸性培养基。琼脂有凝固培养基的作用,可影响培养基内的水分,其浓度对植物生长也存在一定影响。琼脂浓度低,培养基内水分多,不利于植物生长分化,会有玻璃化现象产生;琼脂浓度高,培养基偏硬,会使植物失水,造成植株萎蔫[14]。这与本试验结果一致,在单因素试验中,琼脂浓度低于 7 g/L 时,有玻璃化现象,植株长势不佳。
  在试验中发现,光照度过高、琼脂浓度过低时会产生玻璃化苗。玻璃化是一种植物在离体快繁中发生的生理、形态异常的现象,可危害试管苗正常生长。玻璃化苗植株矮小,茎干透明状,叶片透明状,脆弱失绿,长势不佳[15]。产生玻璃化的原因有很多,高温密封的培养环境、高浓度的植物激素加速了植物生长,瓶内气体浓度发生变化,供植物正常生长的气体交换环节受到影响,易产生玻璃化[16]。温度过高、湿度过大、生长调节剂浓度高、继代次数太多,都易出现玻璃化现象,影响植株长势[17]。对于轻度的玻璃化苗,增加蔗糖浓度,添加活性炭可使其缓解或恢复[18]。在组培试验中,要严格控制通风、温度、光照等培养环境,控制激素浓度,避免或减少玻璃化苗的产生。
  在单因素试验中,光照度、琼脂浓度、pH值的最佳增殖系数分别为6.9、6.5、5.9。而优化试验中最佳增殖系数为 10.73,明显高于单因素的试验结果。响应面分析法是一种试验次数少、回归方程精度高、能研究多因子间交互作用的研究方法,其高效便捷,可节省人力、成本和时间[19-20]。优化试验的结果显示,最适合红颜草莓增殖的培养环境如下:琼脂浓度 7.1 g/L,pH值为5.37,光照度为2 177 lx,增殖系数为 10.73。陈英等研究得到的最佳增殖系数为6.62[21]。翟婷婷研究得出的最佳增殖系数为5.0[22],与现有研究相比本试验的增殖系数高于已报道的部分研究结果,说明筛选增殖条件有实际意义。
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  收稿日期:2018-09-05
  基金項目:吉林省重点科技攻关项目(编号:20140204026NY)。
  作者简介:姚思扬(1994—),女,山东寿光人,硕士研究生,主要从事观赏植物资源引种驯化及繁殖技术研究。E-mail:1575603119@qq.com。
  通信作者:赵春莉,博士,副教授,主要从事观赏植物资源引种驯化及繁殖技术研究。E-mail:zcl8368@163.com。
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