响应面法优化草莓品种红颜离体繁殖的增殖条件

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　　摘要：为了研究优化红颜草莓继代增殖培养的条件，以草莓品种红颜继代组培苗为试验材料，利用响应面法对其增殖条件进行优化。在单因素的试验基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以琼脂浓度、光照度、pH值为试验因子，以增殖系数为响应值，进行3因素3水平的试验设计。结果表明：3因素对植株增殖系数的影响力大小为光照度>pH值>琼脂浓度，最终得到的二元回归方程显示，红颜草莓增殖条件的优化结果如下：琼脂浓度为 7.1 g/L，pH值为5.37，光照度为2 177 lx。在此条件下，最佳增殖系数预测值为10.930 5，实际操作结果为10.73。
　　关键词：草莓品种;离体繁殖;增殖条件;响应面法
　　中图分类号： S668.404+.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）23-0088-04
　　草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是蔷薇科草莓属多年生草本植物，红颜（Benihoppe）为著名的日本品种，是以幸香和章姬为亲本杂交选育而来的，其果实鲜红饱满，味道香甜可口，产量高，耐储存耐运输[1]，深受广大种植者和消费者的喜爱，具有较高的经济价值，拥有广阔的市场。草莓的传统繁殖方法是匍匐茎繁殖和分枝繁殖，效率低，易感染病毒，长久的病毒累积使品种退化，产量降低[2]。经过茎尖脱毒培养后进行离体快繁，不受季节限制，产量高，培养周期短，是获得大量无病毒原种苗的有效手段。
　　目前，关于草莓组培的相关研究，大部分集中于探讨培养基内激素的种类及浓度，旨在筛选出每个阶段的最佳培养基[3-7]，但关于其他培养条件的优化研究鲜有报道。本试验旨在探讨增殖阶段，pH值、光照度、琼脂浓度对其增殖率的影响。并在单因素的试验基础上，参考Box-Behnken的中心组合试验设计原理，用响应面法将各因子的相互关系进行拟合分析，研究各因子与响应值的关系，从而优化红颜草莓的组培条件，以期为今后相关研究提供理论实践基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　试验材料为吉林农业大学温室的当年生草莓匍匐茎尖，于2017年5月采摘，在园艺学院园林生物技术实验室内经初代培养后，选取长势一致的、高2 cm左右的红颜草莓继代组培苗为试验材料。在预试验的基础上，所用的培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，蔗糖浓度30 g/L。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 单因素试验
　　1.2.1.1 pH值对增殖系数的影响 将不定芽接种到培养基内，光照度为2 000 lx，光照时间为14 h/d，培养室温度为 （25±2） ℃，pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，琼脂粉浓度为 7 g/L。每个水平处理10个组培苗，培养周期为30 d。
　　1.2.1.2 光照度对增殖系数的影响 将不定芽接种到培养基内，pH值为6.0，光照时间为14 h/d，培养室温度为（25±2） ℃，光照度为1 200、1 500、1 800、2 100、2 400 lx。琼脂粉浓度为7 g/L，每个水平处理10个组培苗，培养周期为30 d。
　　1.2.1.3 琼脂浓度对增殖系数的影响 将不定芽接种到培养基内，pH值为6.0，光照时间为14 h/d，光照度为2 000 lx，培养室温度为（25±2） ℃，琼脂浓度为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 g/L，每个水平处理10个组培苗，培养周期为30 d。
　　1.2.2 响应面优化试验 在单因素试验的基础上，用响应面分析法，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以pH值、光照度、琼脂浓度为试验因子，增殖系數为响应值，进行3因素3水平的试验设计，见表1。每个水平处理10个组培苗，培养周期为30 d。
　　1.3 数据分析
　　用SPSS和Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析。增殖系数=培养30 d后不定芽总数/接种的不定芽数。
　　2 结果与分析
　　2.1 单因素试验结果
　　2.1.1 pH值对增殖系数的影响 由表2可知，pH值为5.5时，试管苗呈翠绿色，植株健壮，与其他大部分处理间差异显著。当pH值为6.0时，增殖系数随着pH值的继续升高而降低。当pH值为7.0时，培养基内环境为碱性，增殖系数只有3.30，植株矮小，长势不佳。由此可见，草莓增殖阶段更适于酸性的培养环境，碱性环境会抑制其增殖与生长，增殖培养的最适pH值为5.5，增殖系数可达5.90。
　　2.1.2 光照度对增殖系数的影响 由表2可知，增殖系数随光照度的增大呈先上升后下降的趋势，在光照度 1 200 lx 下，试管苗生长缓慢，长势不佳，增殖率只有3.1。随着光照度的增加，植株长势随之变好，增殖系数随之增加，但光照度为2 400 lx时，增殖系数下降，且试管苗失绿变透明状，有玻璃化现象。由此可见，光照度过低会抑制植株生长，过高会产生玻璃化苗，不利于植株生长，增殖培养的最佳光照度为 2 100 lx，增殖系数为6.90。
　　2.1.3 琼脂浓度对增殖系数的影响 由表2可知，琼脂浓度低于7.0 g/L时，增殖系数都低于5，植株矮小且有玻璃化苗产生。当琼脂浓度≥7.0 g/L时，植株生长健壮，无玻璃化苗。C4、C5这2处理差异不显著，都有很好的增殖效果，且植株长势极佳，但从经济成本上考虑，筛选出最适宜增殖培养的琼脂浓度为7.5 g/L，增殖系数为6.50。
　　2.2 响应面优化试验结果
　　2.2.1 二元模型的建立与分析 以增殖系数（Y）为响应值，琼脂浓度（X1）、pH（X2）、光照度（X3）为因素，经过Design-Expert 8.0.6软件分析，得出的回归方程模型为Y=10.66+0.36X1-0.89X2+1.00X3+0.33X1X2+0.050X1X3+020X2X3-0.89X21-1.54X22-1.87X23。该回归模型P为 0.000 3<0.01，有极显著差异，失拟项为0.174 6>0.05，差异不显著，模型稳定性较好。该方程响应面试验设计与结果见表3。R2=0.962 6，说明方程拟合性良好，试验误差小。由表4可知，X1对响应值影响不显著，X2、X3影响极显著，3因素对增殖系数的影响力大小为X3>X2>X1，X1、X2、X3的二次项都对响应值有极显著影响，交互作用影响均不显著。 　　2.2.2 响应面分析 根据拟合方程，绘制3因素之间交互作用的响应面图和等高线图，各图表示在1种因素取值为0时，其他2种因素对响应值的影响。响应面曲面的陡峭程度可表明因素对响应值的影响力大小，曲面越陡，影响力越大，反之则越小。由等高线的形状可知交互效应的强弱，椭圆形表明效应显著，圆形则相反[8]。由图1、图2、图3可知，有关琼脂浓度的曲面较平缓，可见琼脂的影响力小。关于光照度的曲面都很陡峭，可见光照度是影响力最大的因素。通过等高线图及响应面图可见琼脂浓度与pH值的交互作用影响力最大，其次是光照度与pH值，影响力最小的是光照度与琼脂浓度的交互作用。
　　2.2.3 模拟方程的验证试验 通过二次回归方程的分析可得出红颜草莓增殖的最优条件如下：琼脂浓度为7.08 g/L，pH值为5.37，光照度为2 176.99 lx，最佳增殖系数预测值为10.930 5。对该模型进行3次验证试验， 试验条件如下：琼脂浓度为7.1 g/L，pH值为5.37，光照度为2 177 lx。每次处理10个不定芽，得出的3次结果为10.7、11.2、10.3，平均值为10.73。与预测值十分接近，说明方程与真实试验拟合度较好，该优化方案有实际意义和可行度。
　　3 讨论与结论
　　光照度是影响植物光合作用的主要因素，在一定范围内，随着光照度的增强， 植株长势随之变好。但光照度超过一定
　　范围，则会对植物产生不利影响[9]。不同种类的组培苗所需光照差异性较大，如红树莓增殖阶段的最适光照度为 1 500 lx[10]，紫花含笑在8 000 lx的强光下更适于芽的生长[11]，金叶复叶槭在4 200 lx的光照度下生长效果最佳[12]，香蕉组培苗增殖阶段只需1 000 lx光照度[13]。在组培的不同阶段，所需光照度不同，通常在生根阶段组培苗所需的光照更多，随着组培苗生长状态的变化，要合理调控光因素，才可使植株更好生长，可见光照是影响组培苗生长的重要因素。不同植物所需的培养基酸碱环境不同，本试验证明，红颜草莓更适于酸性培养基。琼脂有凝固培养基的作用，可影响培养基内的水分，其浓度对植物生长也存在一定影响。琼脂浓度低，培养基内水分多，不利于植物生长分化，会有玻璃化现象产生;琼脂浓度高，培养基偏硬，会使植物失水，造成植株萎蔫[14]。这与本试验结果一致，在单因素试验中，琼脂浓度低于 7 g/L 时，有玻璃化现象，植株长势不佳。
　　在试验中发现，光照度过高、琼脂浓度过低时会产生玻璃化苗。玻璃化是一种植物在离体快繁中发生的生理、形态异常的现象，可危害试管苗正常生长。玻璃化苗植株矮小，茎干透明状，叶片透明状，脆弱失绿，长势不佳[15]。产生玻璃化的原因有很多，高温密封的培养环境、高浓度的植物激素加速了植物生长，瓶内气体浓度发生变化，供植物正常生长的气体交换环节受到影响，易产生玻璃化[16]。温度过高、湿度过大、生长调节剂浓度高、继代次数太多，都易出现玻璃化现象，影响植株长势[17]。对于轻度的玻璃化苗，增加蔗糖浓度，添加活性炭可使其缓解或恢复[18]。在组培试验中，要严格控制通风、温度、光照等培养环境，控制激素浓度，避免或减少玻璃化苗的产生。
　　在单因素试验中，光照度、琼脂浓度、pH值的最佳增殖系数分别为6.9、6.5、5.9。而优化试验中最佳增殖系数为 10.73，明显高于单因素的试验结果。响应面分析法是一种试验次数少、回归方程精度高、能研究多因子间交互作用的研究方法，其高效便捷，可节省人力、成本和时间[19-20]。优化试验的结果显示，最适合红颜草莓增殖的培养环境如下：琼脂浓度 7.1 g/L，pH值为5.37，光照度为2 177 lx，增殖系数为 10.73。陈英等研究得到的最佳增殖系数为6.62[21]。翟婷婷研究得出的最佳增殖系数为5.0[22]，与现有研究相比本试验的增殖系数高于已报道的部分研究结果，说明筛选增殖条件有实际意义。
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　　收稿日期：2018-09-05
　　基金項目：吉林省重点科技攻关项目（编号：20140204026NY）。
　　作者简介：姚思扬（1994—），女，山东寿光人，硕士研究生，主要从事观赏植物资源引种驯化及繁殖技术研究。E-mail：1575603119@qq.com。
　　通信作者：赵春莉，博士，副教授，主要从事观赏植物资源引种驯化及繁殖技术研究。E-mail：zcl8368@163.com。
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