两种刺玫花粉离体萌发培养液配方的优化

来源:用户上传      作者: 王泽翻,韩倩,杨恒,李亚齐,曾凡景,孙健,赵惠恩

　　摘要：以报春刺玫（Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ）和单瓣黄刺玫（Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ）储存花粉为材料，设计单因素试验和正交试验，考察了蔗糖、硼酸及Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ浓度对两种刺玫花粉萌发率的影响。结果表明，适宜浓度的蔗糖和硼酸能促进花粉萌发，而较高浓度的Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ会抑制花粉萌发。正交试验结果表明适合报春刺玫花粉萌发的最佳培养基为２０％蔗糖（质量分数，下同）＋１００ ｍｇ／Ｌ硼酸；适合单瓣黄刺玫花粉萌发的最佳培养基为１０％蔗糖＋５０ ｍｇ／Ｌ硼酸。
　　关键词：报春刺玫（Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ）；单瓣黄刺玫（Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ）；花粉萌发；液体培养基
　　中图分类号：Ｓ６８５．１２；Ｑ９４５．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）05－1030-03
　　
　　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆｏｒｍｕｌａ ｆｏｒ ｉｎ Vｉｔｒｏ Ｐｏｌｌｅｎ Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ
　　Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ ａｎｄ Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ
　　
　　ＷＡＮＧ Ｚｅ－ｆａｎ，ＨＡＮ Ｑｉａｎ，ＹＡＮＧ Ｈｅｎｇ，ＬＩ Ｙａ－ｑｉ，ＺＥＮＧ Ｆａｎ－ｊｉｎｇ，ＳＵＮ Ｊｉａｎ，ＺＨＡＯ Ｈｕｉ－ｅｎ
　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｓｔｏｒｅｄ ｐｏｌｌｅｎ ｏｆ Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ ａｎｄ Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ， ｓｉｍｐｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ， Ｈ３ＢＯ３ ａｎｄ Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｌｌｅｎ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ ｒｏｓｅ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｕｃｒｏｓｅ ａｎｄ Ｈ３ＢＯ３ ａｔ ｐｒｏｐｅｒ ｄｏｓｅ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｏｓｅ ｐｏｌｌｅｎ； Wｈｉｌｅ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ could ｉｎｈｉｂｉｔ ｐｏｌｌｅｎ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒｍｕｌａ ｆｏｒ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ． ｐｒｉｍｕｌａ ｐｏｌｌｅｎ ｗａｓ ２０％＋ｓｕｃｒｏｓｅ １００ ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３， ａｎｄ ｆｏｒ Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ ｐｏｌｌｅｎ ｗａｓ １０％ ｓｕｃｒｏｓｅ ＋５０ ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３。
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ； Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ； ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｌｅｎ； ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
　　
　　报春刺玫（Ｒｏｓａ ｐｒｉｍｕｌａ）、单瓣黄刺玫（Ｒ． ｘａｎｔｈｉｎａ）为蔷薇科蔷薇属灌木，是原产我国的早花、耐旱、耐寒、耐病、抗性强种质［１］。马燕等［２］自１９８６年起利用报春刺玫、单瓣黄刺玫与现代月季进行远缘杂交，在众多杂交后代中选出了多个观赏性和抗逆性都表现优良的品种，可见以两种刺玫作为父本进行杂交育种，培育抗性强的月季品种具有巨大的潜力。但这两个种花期较早，在北京于４月底至５月初开花，而现代月季品种一般集中在６月开花，父母本花期不相遇，需采集父本花粉进行储藏。
　　保证储存的离体花粉有较高的萌发率是进行杂交育种的必要条件，花粉离体萌发需要合适的条件，其主要因素为温度和培养基［３］。已有的报道中对月季花粉萌发培养基的研究多集中在蔗糖和硼酸上，如Ｒｉｃｈｅｒ等［４］研究了３个品种的花粉萌发最适蔗糖浓度，Ｖｏｙｉａｔｚｉ［５］研究了５个月季品种花粉萌发所需的蔗糖和硼酸浓度，孙宪芝［６］初步研究了蔗糖和硼酸对一些野生种和现代月季花粉萌发的影响，但未进行系统的培养基组分的优化设计研究。钙是花粉萌发的启动者和花粉管生长的调节者［７，８］，适当浓度的外源Ｃａ２＋能够促进花粉萌发和花粉管生长［９］。王岚岚等［１０］研究了蔗糖、Ｂ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｋ对月季花粉萌发的影响，结果发现蔗糖、Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ和硼酸的交互作用对“Ｓｏｒｂｅｔ ｆｒｕｉｔｅ”花粉萌发有极显著影响。本研究探讨了蔗糖、Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ和硼酸对两种刺玫花粉萌发的影响，在此基础上采用正交设计选出最佳培养液配方，为杂交育种工作提供参考。
　　１ 材料与方法
　　１．１ 材料
　　花粉采自北京林业大学生长多年的单瓣黄刺玫和报春刺玫的成熟植株上的花朵，花粉散出及收集方法参考孙宪芝［６］的方法，而后置于－２０ ℃储存。
　　１．２ 试验方法
　　储存４０ ｄ后于杂交前取出花粉，先用ＴＴＣ法测定花粉生命力，丢弃无生命力的花粉，取有生命力的花粉进行花粉萌发试验。采用液体培养基悬滴培养法，将花粉置于２３ ℃条件下培养，２４ ｈ后置于电子显微镜下观察。每种培养液观察３个玻片，每个玻片观察３个视野，每个视野不少于１００粒花粉，花粉管长度超过花粉粒半径的花粉视为萌发。花粉萌发率＝视野内萌发花粉数／该视野花粉总数×１００％。
　　１．２．１ 单因素试验 分别考察培养液中蔗糖、硼酸和Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ浓度对两种刺玫花粉萌发率的影响。①蔗糖。培养液中蔗糖的质量分数分别为０、５％、１０％、１５％、２０％。②硼酸。培养液中分别添加０、１０、５０、１００、２００ ｍｇ／Ｌ的硼酸。③Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ。培养液中Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ的浓度分别为０、１０、５０、１００、２００ ｍｇ／Ｌ。
　　１．２．２ 正交试验 在单因素试验的基础上，设计Ｌ９（３４）正交试验，考察蔗糖、硼酸和Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ浓度３个因素对两种刺玫花粉萌发率的影响。因素与水平见表１。
　　２ 结果与分析
　　２．１ 单因素试验结果
　　２．１．１ 蔗糖对两种刺玫花粉萌发率的影响 以不同浓度蔗糖溶液培养花粉，两种刺玫花粉萌发率的变化趋势相同（表２）。蔗糖质量分数为１０％～20％时较适合两种刺玫花粉的萌发。蔗糖质量分数为１５％时两种花粉萌发率最高，报春刺玫为３９．２％，单瓣黄刺玫为２９．９％。蔗糖质量分数为２０％时，花粉萌发率略有下降，表明蔗糖浓度过高会抑制花粉的萌发。
　　２．１．２ 硼酸对两种刺玫花粉萌发率的影响 报春刺玫花粉萌发率在硼酸浓度为５０ ｍｇ／Ｌ时最高，为１2．6％；单瓣黄刺玫花粉萌发率在硼酸浓度为１００ ｍｇ／Ｌ时最高，为8．7％（表３）。硼酸的浓度过高或过低均不利于花粉的生长。
　　２．１．３ Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ对两种刺玫花粉萌发率的影响 Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ浓度为１０ ｍｇ／Ｌ时，两种刺玫花粉萌发率均最高，报春刺玫为１2．8％，单瓣黄刺玫为１０．０％（表４）。之后随着Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ浓度上升，两种花粉萌发率均下降，可见过高的Ｃａ2+浓度会抑制两种刺玫花粉的萌发。

　　２．２ 正交试验结果
　　正交试验结果见表５，影响报春刺玫花粉萌发率的３个因素中，硼酸浓度的影响最大，蔗糖浓度的影响最小。报春刺玫最佳培养液配方为Ａ３Ｂ３Ｃ１，即蔗糖质量分数为２０％，硼酸浓度为１００ ｍｇ／Ｌ，不添加Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ。影响单瓣黄刺玫花粉萌发率的因素中，硼酸浓度的影响最大，其次为蔗糖浓度，Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ的影响最小。单瓣黄刺玫花粉萌发的最佳培养液配方为Ａ１Ｂ２Ｃ１，即蔗糖质量分数为１０％，硼酸浓度为５０ ｍｇ／Ｌ，不加Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ。
　　３ 结论与讨论
　　蔗糖在花粉萌发中主要起到提供能源和调节渗透压的作用［１１，12］。单因素试验表明，质量分数在１０％～２０％的蔗糖溶液较适合两种刺玫花粉萌发，其中蔗糖质量分数为１５％时两种刺玫花粉萌发率最高，该结果与Ｒｉｃｈｅｒ等［４］的研究结果一致。孙宪芝［6］研究发现质量分数为５％～８％的蔗糖溶液适于大多数蔷薇属植物花粉的萌发，明显低于本试验的最适萌发浓度，可能是由于新鲜花粉与储存花粉在吸收代谢等方面的差异所致。同时，电镜下观察发现，各单因素试验中，只添加蔗糖的培养液中萌发的花粉管长度明显大于只添加了硼酸或Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ的培养液中花粉管的长度，表明适宜浓度的蔗糖对花粉的萌发起着重要的促进作用。
　　硼能促进糖的吸收和代谢，且有利于花粉管壁的形成，可以减少花粉破裂，显著提高花粉萌发率，并促使花粉管生长伸长［１３］。单因素试验显示，低浓度的硼酸促进刺玫花粉的萌发，硼酸浓度过高，花粉的萌发率下降，与Ｖｏｙｉａｔｚｉ［５］报道的结果相符合。
　　Ｃａ２＋影响花粉管内细胞骨架的生理活动，在花粉管顶端形成较厚的管壁，影响花粉管的生长［１２］。单因素试验中，Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ浓度为１０ ｍｇ／Ｌ时，两种花粉萌发率最高，高于此浓度时，两种花粉萌发率随其浓度的升高而下降。
　　正交试验中，几种营养元素同时存在，花粉萌发率和花粉管的长度显著高于单因素试验中只添加一种营养元素时花粉的萌发率。这可能是由于硼离子能与蔗糖形成络合物，使糖易于通过质膜在组织中运输，从而促进糖的吸收与代谢，加之硼能参与果胶物质的合成，利于花粉管壁的建造［１３］。而Ｃａ２＋的加入在一定程度上抑制了两种刺玫花粉的萌发，正交试验结果表明不加Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ的组合花粉萌发率反而要高，其原因有待于进一步分析。
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