滩涂土壤和种植土壤中细菌多样性的比较

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　　摘要：以沿海滩涂土壤和种植土壤中的细菌为研究对象，采用传统分离培养和现代分子生物学技术对滩涂土壤和种植土壤中细菌的种类和丰度进行初步研究和比较。隶属于疣微菌门的Subdivision3 genera incertae sedis，地杆菌属，隶属于酸杆菌门的Gp2、Gp4、Gp6，芽单胞菌属，Lacibacterium，硝化螺旋菌属，Povalibacter以及丰祐菌属在种植土样本中较为丰富，但在滩涂土样本中却比较匮乏;硫深海菌属，脱硫单胞菌属，Loktanella，泞杆菌属，硫代盐单胞菌属在滩涂土样本中较为丰富，但在种植土样本中却很少见。研究表明，滩涂土壤与种植土壤的微生物群落结构差异显著。研究结果为滩涂土壤改良中微生物群落结构变化的监测提供了一定的理论与实践基础。
　　关键词：滩涂土壤;种植土壤;细菌;微生物群落多样性;PCR;高通量测序
　　中图分类号： S182
　　文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）02-0271-05
　　收稿日期：2018-10-17
　　作者简介：周 恒（1995—），男，江苏连云港人，硕士研究生，主要从事海洋微生物生物活性及天然活性物质研究。E-mail：970069241@qq.com。
　　通信作者：缪 莉，博士，副教授，主要从事海洋微生物资源和海洋微生物活性及天然活性物质研究。E-mail：miaoli@yzu.edu.cn。
　　我国海岸线漫长，有辽阔的土壤面积，其中滩涂土壤面积约为200万hm2。沿海地区由于气候适宜，有充足的降水，雨热同季，因此沿海滩涂土壤毫无疑问是一块非常宝贵的后备土地资源[1]。在人口不断增加、耕地日趋减少、淡水资源不足的压力下，如何高效合理地改良利用大面积的盐渍土壤，是我国面临的一个迫在眉睫的问题[2]。近几年，微生物群落结构以及多样性分析逐渐成为研究的热点，李新等研究了不同盐碱程度的土壤细菌多样性以及其优势种群[3-4]。刘菲菲的研究表明，对目标环境微生物群落结构和多样性进行研究和分析，可以为优化群落结构、调节群落功能和发现新的重要的微生物功能类群提供可靠的依据[5]。微生物群落结构和多样性的分析能够较为准确地掌握各个菌群之间的关系，从而指导微生物群落功能的定向调控[5]。本试验通过研究滩涂土壤和种植土壤中细菌群落的差异，讨论滩涂土壤和种植土壤中的优势菌群，探讨如何把农用率低的沿海滩涂土壤人工改良为适合种植的土壤，寻找改良滩涂土壤一些关键菌群，以期为提高滩涂土壤的农业利用率，促进农业经济发展提供理论基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　本研究所用的种植土壤采自扬州大学绿色种植试验田，选取农田土层表面以下5～10 cm土层新鲜度较高的湿润土壤，不含土壤生物，不含植物根际等杂质，较纯，以避免提取土壤细菌微生物的DNA时混有大量土壤生物的DNA，影响试验结果。土壤pH值为7～8，中性偏碱。研究所用的滩涂土壤为上海市沿海未开垦的位于涂层表面10 cm以下的新鲜土壤，选取不同湿润梯度的滩涂土壤，为了便于进行土壤细菌DNA的提取，采用较为干实的滩涂土壤，pH值为7.0～8.5，中性偏碱。
　　LB培养基：酵母粉5 g，胰蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，pH值为7.0～7.2，水1 000 mL。PDA培养基：马铃薯200 g（切片水煮30 min，过滤取汁），葡萄糖 20 g，琼脂15 g，pH值为7.0。高氏一号培养基：可溶性淀粉 20 g，硝酸钾1 g，磷酸氢二钾 0.5 g，七水硫酸镁 0.5 g，氯化钠 0.5 g，七水硫酸亚铁 0.01 g，pH值为7.4～7.6。土壤DNA提取试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 土壤微生物分离培养及计数 试验采用传统分离培养技术对种植土壤和滩涂土壤中的微生物分別进行培养、计数，比较其丰度。制作固体培养基，将土壤样品用无菌水稀释至一定的浓度梯度并进行涂布，每个浓度梯度做5个平行对照，置于恒温培养箱中培养。3 d后，对培养细菌的LB平板进行计数;5～7 d 后，对培养真菌的PDA平板进行计数;10～14 d 后，对培养放线菌的高氏一号平板进行计数。
　　1.2.2 土壤样品DNA的提取及验证 用土壤DNA提取试剂盒并按照试剂盒所述的步骤提取土壤样品DNA。制作1%琼脂糖凝胶，取5 μL待验证样品DNA，加入1 μL 6×loading buffer，简单混匀后上样，90 V，电泳1 h;电泳结束后，将凝胶放置于紫外凝胶成像仪下观察是否有DNA条带，并使用Nano Drop测土壤样品DNA的浓度。
　　1.2.3 PCR扩增 以土壤样品中细菌的DNA为模板和1对V3、V4正反向通用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCA-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）[7]，利用DNA聚合酶对模板DNA进行PCR扩增。PCR为50 μL反应体系：各 0.2 μmol/L 正反向引物，1.5 U Pfu DNA聚合酶，4 μL 10×Pfu DNA聚合酶缓冲液，10 μmol/L dNTPs，100 ng样品DNA，用ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃，3 min;95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35个循环;72 ℃，10 min;12 ℃冷却。PCR反应结束后，用质量分数为1%的琼脂糖凝胶在90 V，电泳1 h，进行验证。
　　1.2.4 高通量测序 提取出的DNA样品由生工生物工程（上海）股份有限公司进行高通量测序。高通量测序的主要流程包括样品DNA进行PCR扩增后的样本准备，然后进行文库构建，以便于能够在目的DNA片段两端都连接上想要的接头。接下来进行测序，得到DNA片段的碱基序列，最后进行数据分析，与基因库的数据进行对比分析。 　　2 结果与分析
　　2.1 分离培养的计数结果
　　用传统的分离培养技术分别对种植土壤、滩涂土壤中的细菌、真菌、放线菌进行分离培养并进行计数。由表1可知，种植土壤和滩涂土壤中都是细菌数量最多，分别为1.6×106、4.3×105 CFU/g，放线菌次之，分别为7.3×105、2.4×104 CFU/g，真菌数量最少，分别为1.5×104、1.3×102 CFU/g。由于滩涂土壤中生存条件较为苛刻，滩涂土壤中细菌、放线菌、真菌数量明显小于种植土壤，尤其是真菌的数量，与种植土壤相比，少2个数量级。
　　2.2 土壤样品DNA提取及检测
　　对土壤样品分别进行DNA提取，琼脂糖凝胶电泳验证，对提取得到的DNA质量进行观察，结果（图1）表明，滩涂土壤、种植土壤DNA跑胶样品均只有1条明显的亮带，没有其他的杂带，且位置在 5 kb 之上。说明从样品中提取的DNA较为完整，并无其他杂质;种植土壤DNA跑胶条带明显亮于滩涂土壤条带，说明种植土壤样品中DNA浓度远高于滩涂土壤样品，种植土壤中细菌含量明显大于滩涂土样品。
　　使用NanoDrop测定滩涂土壤样品、种植土壤样品中DNA浓度，结果显示滩涂土壤样品DNA浓度为 4.8 ng/μL，种植土壤样品DNA浓度为 8.9 ng/μL。由所测得的数据可知，种植土壤中的细菌含量大于滩涂土壤样品。对提取得到的DNA样品的D260 nm/D280 nm进行测定。结果显示，滩涂土壤样品和种植土壤样品的D260 nm/D280 nm分别为1.89、1.93，均在1.8～2.0之间，说明提取的滩涂土壤样品、种植土壤样品中的DNA都较纯，质量很好。
　　2.3 测序结果分析
　　2.3.1 测序结果 对2个土壤样品进行高通量测序，根据结果对序列进行统计，由表2可知，共得到原始序列50 111条，经过处理后得到优质序列 48 247 条。在97%的相似水平下对序列进行操作單元（OTU）的聚类，统计得到所有样品在不同OTUs中的丰度信息，共产生12 930个OTU，其中相似的OUT分布数目为204，约占1.58%。
　　2.3.2 土壤样品取样深度验证 稀释曲线反映了样品的取样深度，可以用来评价测序量是否足以覆盖所有类群。由图2可知，2个土壤样品的稀释曲线未趋于平缓，说明测序数据量偏小，不足以较为完整地反映土壤样品的细菌群落，继续测序还可能产生较多新的OTU。
　　2.3.3 Alpha多样性分析 Shannon指数可以用来表示细菌群落的多样性程度，Shannon指数越大，说明群落多样性越高。由图3可以看出，2个土壤样本的曲线都趋向平坦，说明测序数据量足够大，可以反映土壤样品中绝大多数的细菌物种信息;种植土壤样本的Shannon曲线的最高点高于滩涂土壤样本的Shannon曲线，说明种植土壤样品中细菌多样性大于滩涂土壤样品，种植土壤中细菌物种较为丰富。
　　2.3.4 聚类分析 在属的水平上，对土壤样品中的细菌进行聚类，依据聚类后的各土壤样品中不同OTU所含序列数目做出热图（图4），该图能够反映出在菌属水平上各样品细菌群落结构的差异性。其中，图中1列表示1个样本，1行代表1个群落结构。颜色块代表相对物种丰度值，颜色越红代表相对丰度越高，颜色越蓝则相对丰度越低。
　　由图4可知，种植土壤样本中主要的菌属有隶属于疣微菌门的Subdivision3 genera incertae sedis，地杆菌属（Geobacter），脱硫单胞菌属（Desulfuromonas），隶属于酸杆菌门的Gp2、Gp4、Gp6，芽单胞菌属（Gemmatimonas），Lacibacterium，硝化螺旋菌属（Nitrospira），Povalibacter，丰祐菌属（Opitutus），埃希氏菌属（Escherichia），还有一些未知分类地位的菌属;滩涂土壤样品中主要的菌属有硫深海菌属（Thioprofundum），脱硫单胞菌属（Desulfuromonas），Loktanella，埃希氏菌属（Escherichia），泞杆菌属（Lutibacter），硫代盐单胞菌属（Thiohalomonas），隶属于酸杆菌门的Gp10、Gp22，淡黄杆菌属（Luteolibacter），脱硫念珠菌属（Desulfomonile）以及一些未知分类地位的菌属。
　　在种植土壤样品中隶属于疣微菌门的Subdivision3 genera incertae sedis，地杆菌属（Geobacter），隶属于酸杆菌门的Gp2、Gp4、Gp6，芽单胞菌属（Gemmatimonas），Lacibacterium，硝化螺旋菌属（Nitrospira），Povalibacter，丰祐菌属（Opitutus）较为丰富，但是相对的在滩涂土壤样品中这些菌属却比较匮乏。在滩涂土样品中硫深海菌属（Thioprofundum），脱硫单胞菌属（Desulfuromonas），Loktanella，泞杆菌属（Lutibacter），硫代盐单胞菌属（Thiohalomonas）较为丰富，但是相对的，在种植土壤样品中这些菌属却较为匮乏。
　　2.3.5 土壤细菌群落组成及丰度 从图5中可以看出，种植土壤中的优势菌属为地杆菌属（Geobacter），所占比例为5.17%，其次是隶属于疣微菌门的Subdivision3 genera incertae sedis，所占比例为5.10%，其他的优势菌属为隶属于酸杆菌门的Gp6，所占比例为2.65%;芽单胞菌属（Gemmatimonas）所占比例为2.31%;Lacibacterium所占比例为2.23%;硝化螺旋菌属（Nitrospira）所占比例为 1.74%;Povalibacter所占比例为1.72%;隶属于酸杆菌门的Gp2，所占比例为1.54%;隶属于酸杆菌门的Gp4，所占比例为1.49%;丰祐菌属（Opitutus）所占比例为1.40%。滩涂土壤中的优势菌属为硫深海菌属（Thioprofundum），所占比例为8.07%，其次是脱硫单胞菌属（Desulfuromonas）所占比例为4.16%;Loktanella所占比例为 2.62%;泞杆菌属（Lutibacter）所占比例为2.25%;硫代盐单胞菌属（Thiohalomonas）所占比例为2.14%;脱硫念珠菌属（Desulfomonile）所占比例为1.79%;埃希氏菌属（Escherichia）所占比例为1.49%;隶属于酸杆菌门的Gp10，所占比例为 1.19%;隶属于酸杆菌门的Gp22所占比例为1.15%;淡黄杆菌属（Luteolibacter）所占比例为1.14%。 　　3 结论与讨论
　　通过研究发现，种植土壤和滩涂土壤中细菌的含量最高，放线菌次之，真菌最低;滩涂土壤中细菌、真菌、放线菌多样性均小于种植土壤。本研究所选取的种植土壤样本中细菌的优势菌属为隶属于疣微菌门的Subdivision3 genera incertae sedis，地杆菌属（Geobacter）等。这与已报道的宝天曼落叶阔叶林土壤中的细菌优势群落存在较大的差异，赵爱花等揭示种植土壤中变形菌属为绝对优势菌属[8]。李鹏等研究发现，小蓬竹根际土壤芽孢杆菌属占绝对优势[9]。谭渊等利用PCR-DGGE技术对黄连根际土壤细菌多样性分析发现，优势菌属为嗜酸菌属[10]。本研究中还检测到芽孢杆菌属、嗜酸菌属，但不作为优势菌属。这与Roesch等采用高通量测序方法研究的结果[11-12]不一致，他们发现在一些土壤中，β-变形菌是丰度最高的亚门。不同种植土壤中的微生物种类及丰度差异明显，这可能与检测方法（传统分离培养、PGR-DGGE和高通量测序技术）、土壤的种类、营养物质、光照、温度、湿度、pH值等的不同有关，也许还与土壤中所种植植物的分泌代谢产物有一定的关系。
　　本研究所选取的滩涂土壤为上海市沿海未开垦的滩涂土壤。发现本滩涂土壤样品中的优势菌属为硫深海菌属（Thioprofundum）、脱硫单胞菌属（Desulfuromonas）等。隋心等在利用高通量测序对三江平原小叶章湿地土壤细菌多样性的研究中发现，湿地的主要优势菌群为酸杆菌、变形菌，还包括一些浮霉菌、绿弯菌和硝化螺旋菌，还有一些少量的疣微菌和芽单胞菌属[13]。本研究所分析得到的结果与之有一些相似性也有一些差异性。硝化螺旋菌、疣微菌和芽单胞菌在本次研究所选取的滩涂土壤中也被检测到，同样数量也比较少。但是优势菌属却有较大差异性。三江平原小叶章湿地的优势菌群含有酸杆菌而本研究结果中却没有，这可能与滩涂土壤的pH值有关;造成滩涂土壤中微生物差异性的原因也可能包括灘涂土壤的含水量、含氧量[14]等。
　　本研究采用Illumina MiSeq高通量测序平台对种植土壤、滩涂土壤细菌群落多样性进行研究，初步获得其在门、纲、目、科、属等不同分类水平上的优势类群和相对丰度。研究结果表明，细菌群落在属水平上尚未明确分类信息的类群所占比例较大，使得物种注释时的分辨率降低，基本上只能将细菌注释到属的分类水平。可能是本研究只选用了16S rDNA的 V3～V4可变区进行高通量测序，如果想要注释到种水平，可尝试多选用几个可变区。高通量测序一般可以保证每个样品测定几万个序列数，提高了测序深度和覆盖度，但测序片段较短，约为 435 bp，在一定程度上降低了物种注释的分辨率[15]。
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